Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Arbovirus et virus des fièvres hémorragiques


Responsable : DEUBEL Vincent , Chef d'unité 25, Rue du Dr Roux75724 Paris cedex 15 - Tél: 01 4568 8000 - Fax: 01 4061 3774 ou 01 4061 3151 (E-mail : vdeubel@pasteur.fr)

Résumé du rapport

L¹unité des Arbovirus et virus des fièvres hémorragiques se consacre à l¹étude de deux familles virales représentatives des virus transmissible à l¹homme par des arthropodes, les Flaviviridae et les Bunyaviridae ainsi qu¹à la surveillance du virus Ebola (famille des Filoviridae). Des recherches à caractère fondamental ont pour objet de comprendre les mécanismes de la réplication de ces virus à ARN et d¹analyser les interactions fonctionnelles entre l¹agent infectieux et leurs cellules hôtes. A l¹interface de ces recherches, le Centre National de Référence développe des outils de diagnostic rapide pour la surveillance des maladies émergentes associées aux arbovirus et aux virus des fièvres hémorragiques.

Abstract

The Unit of Arboviruses and haemorrhagic fever viruses conducts researches on two families of arthropod borne viruses, Flaviviridae and Bunyaviridae, and on the surveillance of Ebola virus (Filoviridae). Fields of basic research are dedicated to the understanding of the replication strategy of these RNA viruses and to the analysis of fonctional interactions between viruses and their host cells. The Unit also includes a reference branch wich develops rapid diagnostic tools for the surveillance of emerging diseases related to arboviruses and haemorrhagic fever viruses.

Texte du rapport

Les arbovirus ont été initialement définis comme ³maintenus dans la nature par un cycle de transmission biologique entre des hôtes vertébrés permissifs et des arthropodes hématophages². Certains d¹entre eux ne correspondent pas à cette définition, mais ont été classés dans le catalogue des arbovirus pour leur apparenté écologique et non taxonomique. Plus de 100 virus pathogènes pour l¹homme à des degrés divers sont universellement répertoriés. Ces virus entrainent des manifestations pathologiques qui sont à l'origine de symptomologie inérente liée à chaque virus (syndromes fébriles algiques, syndromes méningo-encéphalitiques, syndromes hémorragiques) pouvant conduire à la mort de l¹hôte. Les virus des fièvres hémorragiques appartiennent aux familles des Bunyaviridae, des Flaviviridae, des Arenaviridae et des Filoviridae. La majorité de ces virus circulent sous les tropiques, en raison de l¹abondance des hôtes et des vecteurs: c¹est notamment le cas des virus de la fièvre jaune, de la dengue et de la fièvre de la vallée du Rift. Plusieurs d¹entre ces virus sont cependant retrouvés dans les zones tempérées, en Europe centrale, de l¹est et du sud. Au niveau national, trois virus majeurs sont sous haute surveillance : les flavivirus de l¹encéphalite à tique d¹Europe centrale et West-Nile, introduit épisodiquement par les oiseaux migrateurs, et un hantavirus dont le réservoir est un rongeur auprès duquel l¹homme se contamine. Malgré de nombreux travaux, beaucoup d¹inconnues demeurent aux niveaux fondamental et épidémiologique sur les flavivirus, les bunyavirus et les filovirus. Notre Unité a développé en particulier des recherches pour cinq viroses importantes qui peuvent conduire à des syndromes hémorragiques et qui posent de graves problèmes de Santé Publique dans plusieurs continents, et tout particulièrement dans les Départements et Territoires d¹Outre-Mer ainsi que dans les pays où notre Institut est représenté: dengue, fièvre jaune, fièvre de la vallée du Rift, fièvre hémorragique à virus Ebola, fièvre hémorragique avec syndrome rénal (virus Puumala). Nos activités de recherche et de référence sur les arbovirus et les fièvres hémorragiques virales ont dépassé les frontières et sont menées en collaboration avec nos partenaires privilégiés du réseau international des Instituts Pasteur et Instituts associés. Ces collaborations sont d'une grande richesse et favorisent le développement de la recherche grâce à des transferts d¹information, de matériel et de technologies.

Le virus de la dengue

(V. Deubel)

La dengue est une maladie virale transmissible à l'homme par les moustiques du genre Aedes dans les régions tropicales et intertropicales qui ceinturent le globe. L¹agent infectieux responsable de la maladie est un flavivirus (famille Flaviviridae) dont on distingue quatre sérotypes (dengue-1, -2, -3, et -4). L¹infection par le virus dengue provoque généralement une fièvre non différenciée le plus souvent asymptomatique (fièvre dengue classique, DF, ou grippe des tropiques) mais peut entrainer des manifestations hémorragiques graves (fièvre hémorragique de la dengue, DHF), notifiées par une perméabilité vasculaire accrue et un déréglement de l'hémostase. L'issue de la maladie peut être fatale en cas de choc hypovolémique (dengue avec syndrome de choc, DSS). Les facteurs de l¹hôte ou intrinsèques au virus responsables de la gravité de la maladie ne sont pas connus. Nos thématiques de recherche ont comme ligne directrice l¹étude des marqueurs moléculaires de la diversité biologique du virus de la dengue qui déterminent de manière critique sa virulence et l¹étude des mécanismes qui régissent les interactions du virus avec ses cellules hôtes.

Mécanismes de virulence du virus de la dengue

(P. Desprès, M.P. Courageot, M.P. Frenkiel)

Le virus de la dengue induit la mort cellulaire par apoptose des neurones murins infectés. L¹infection du souriceau par le virus de la dengue est un modèle expérimental pour caractériser d¹une part des marqueurs viraux de la virulence et d¹autre part les interactions hôte-virus in vivo. Des variants hautement neurovirulents d¹une souche humaine du virus de la dengue ont été sélectionnés après neuroadaptation à la souris. Les effets des substitutions en acides aminés dans la protéine d¹enveloppe E et l¹hélicase NS3 ont été comparés entre les variants neurovirulents et la souche parentale, d¹une part dans les cellules hôtes in vivo et in vitro et d¹autre part sur leur niveau d¹infection des moustiques hématophages vecteurs. Les résultats indiquent que trois substitutions dans la protéine d¹enveloppe E et une dans la protéine hélicase NS3 dans un variant neurovirulent confèrent une plus grande capacité du virus à se répliquer dans le système nerveux central murin. De la même façon, le degré d¹infectivité supérieur du variant pour le moustique par rapport à la souche parentale serait lié à sa capacité accrue à se répliquer dans les cellules de l¹insecte. In vitro, la substitution dans NS3 semble interférer sur le cycle réplication du virus DEN dans les neuroblastomes et les substitutions dans la protéine E pourraient conférer au virus de la dengue une plus grande cytotoxicité pour les cellules de neuroblastome murin. (Collaborations : M. Arborio, P.E. Ceccaldi, C. Duarte Dos Santos, M.L. Gougeon, F. Pénin)

Pathologie liée au virus de la dengue

(P. Marianneau,V. Deubel, P. Desprès, M.T. Drouet)

Les organes cibles du virus de la dengue ne sont pas clairement identifiés. Cependant une atteinte hépatique a souvent été trouvée associée aux formes de DHF/DSS. L'analyse des biopsies de foie de patients décédés au cours d'un épisode de DHF/DSS ont permis d'identifier les hépatocytes comme des cellules cibles de l¹infection par le virus de la dengue. Par contre, il n'a pas été possible de déceler du virus dans les cellules de Kupffer. Ces résultats corroborent nos analyses réalisées in vitro sur des hépatocytes et des cellules de Kupffer d'origine humaine en culture: le virus de la dengue infecte les deux types cellulaires et induit leur mort par apoptose. Cependant seuls les hépatocytes produisent du virus infectieux alors que les cellules de Kupffer activées par l'infection virale produisent des substances anti-virales et sont éliminées par phagocytose. L'étude de l'infection du tissu hépatique par le virus de la dengue, in vitro et in vivo, fournit des informations permettant de comprendre la pathologie de la maladie. (Collaborations : M. Huerre, L. Rosen, C. Royer, A.M. Steffan)

Etude des propriétés de la glycoprotéine non structurale NS1

(Marie Flamand, Françoise Mégret, Sophie Alcon, Fasseli Coulibaly)

La glycoprotéine non structurale NS1 du virus de la dengue, dont le rôle demeure inconnu, réside au sein de la cellule infectée. Pour les cellules de mammifères, la protéine est également sécrétée dans le milieu extracellulaire. Nous avons étudié la maturation et le transport de NS1 en cellules de rein de singe (lignée Vero). Nous avons montré que la protéine intracellulaire dimérique réside en grande partie dans un compartiment précoce des voies de sécrétion, où sa présence pourrait être requise lors de la réplication virale. Nous étudions par ailleurs les propriétés biochimiques et structurales de la forme sécrétée, qui pourrait assurer une fonction distincte au cours de l¹infection virale. La protéine est relarguée dans le milieu de culture sous la forme d¹un hexamère. La sécrétion de NS1 est favorisée par la maturation complète de l¹un des deux sucres. Ces observations, associées à l¹absence de production d¹antigène NS1 extracellulaire dans des lignées de cellules d¹insectes, dont la voie de biosynthèse des sucres génère des résidus oligosaccharidiques immatures, suggère que la N-glycosylation hôte-spécifique pourrait représenter un facteur de restriction du phénomène de production de NS1 sécrétoire. L¹implication de la forme circulante de NS1 dans la pathophysiologie de l¹infection chez l¹homme est en cours d¹étude. (Collaborations : M. Arborio, B. Goud, R. Hellio, J. Lepault, M. Mathieu, F. Rey)

Vaccinologie de la dengue

(V. Deubel, M.T. Drouet, M.P. Frenkiel)

Le meilleur moyen de se prémunir contre le virus de la dengue serait une immunoprophylaxie efficace. Un vaccin recombiné composé de protéines de l'enveloppe virale E purifiées a été mis au point dans l'Unité. La protéine E du virus de la dengue induit chez la souris et chez le singe une immunité protectrice liée à la présence d'anticorps neutralisants. Ces résultats sont très encourageants pour la préparation d'un vaccin efficace contre les quatre sérotypes. (Collaborations : L. Edelman, S. Petres)

Le virus de la fièvre de la vallée du Rift (Michèle Bouloy)

Membre de la famille des Bunyaviridae (genre Phlebovirus), le virus de la fièvre de la vallée du Rift (FVR) est responsable de fièvres hémorragiques chez l'homme, d'avortements et malformations du foetus chez les ruminants. De graves épidémies viennent d¹avoir lieu au Kenya, Somalie, Tanzanie et Mauritanie. Ce virus enveloppé possède un génome composé de trois segments d'ARN (L, M, S) de polarité négative dont un, le segment S, est ambisens et code pour deux protéines, la nucléoprotéine N et une protéine non structurale NSs dont la fonction n¹est pas connue. L¹étude de cette protéine a été au centre de nos préoccupations, avec comme ligne directrice l¹analyse de ses propriétés biologiques et de la pathogénie associée au virus.

Transcription du virus de la fièvre de la vallée du Rift (C. Préhaud)

Du fait de sa stratégie ambisens, le segment S génomique est transcrit en un ARNm codant pour N et la molécule S antigénomique en un ARNm codant pour NSs. Un ARN modèle de type génomique ou antigénomique a été utilisé pour étudier cette phase de la transcription. Ces ARN sont transcrits par le système reconstitué où les protéines requises, N et L (ARN polymérase ARN dépendante) sont exprimées sous forme recombinante à partir du virus de la vaccine. L'ARN utilisé comme matrice est un minigénome qui contient le gène CAT (Chloramphénicol Acetyle Transférase) en orientation antisens, flanqué des séquences 3' et 5' non codantes du segment S d¹orientation génomique ou antigénomique. Des mutations dans la région 3' terminale de la matrice indiquent que le complexe de transcription reconnait les 13 premiers nucléotides, parmi lesquels les 8 premiers sont conservés chez tous les phlébovirus, les positions 9 à 12 sont variables et la position 13 doit être une purine. La protéine NSs ne semble pas jouer de rôle particulier dans ce système de transcription. Nous cherchons à établir un système équivalent pour étudier la réplication et rechercher un éventuel rôle de NSs.

La protéine NSs
(F. Yadani et A. Kohl)

Dans les cellules infectées par la quasi totalité des souches, la protéine NSs se localise en majorité dans le noyau où elle forme une structure filamentaire. Afin de mieux comprendre les mécanismes de formation de filaments, la protéine a été exprimée à l¹aide du vecteur Semliki. L¹analyse de différents mutants ponctuels ou de délétion montre que le domaine formé par les dix acides aminés C-terminaux est responsable de la formation du filament mais pas de la localisation nucléaire. Dans la forme native de la protéine, ce domaine contient deux sérines qui sont phosphorylées et présentent une séquence consensus de reconnaissance par la caséine kinase II. Ces deux sites phosphorylés ne jouent pas de rôle important dans le processus de formation du filament car, la protéine où ces deux serines ont été mutées en alanine contine à former le filament nucléaire. (Collaboration : R. Hellio)

Un mutant naturel: le clone 13
(A. Billecocq, P. Vialat)

Le clone 13 a été isolé d¹une souche de virus provenant d¹un cas humain en République d¹Afrique centrale. Ce virus possède une délétion de 70% de la région codante pour la protéine NSs et il est avirulent pour les rongeurs qui représentent un excellent modèle animal. Dans les cellules infectées par le clone 13, la protéine NSs tronquée ne forme pas de filament et reste dans le cytoplasme où elle est dégradée. En outre, les cultures de cellules Vero infectées par Clone 13 peuvent être propagées pendant de nombreux passages et continuent à héberger le génome viral et à exprimer ses protéines. Des réassortants avec une souche virulente ont permis de montrer que le caractère avirulent du clone 13 et sa capacité à établir des infections persistantes sont associés au segment S.

Analyse phylogénétique
(M. Bouloy, A.A. Sall)

La séquence codant pour la protéine NSs représente une cible de choix pour caractériser les souches entre elles. L¹analyse phylogénétique d¹une série de souches isolées de différentes régions d¹Afrique au cours des 50 dernières années montre que les isolats se regroupent en trois classes géographiques: l¹Afrique de l¹Ouest, l¹Afrique du Centre et de l¹Est, l¹Egypte. La séquence d¹une souche isolée par R. Swanepoel (Joanesburg, Afrique du Sud) au cours de la dernière épidémie du Kenya de 1997-98 montre qu¹elle appartient au groupe de l¹Est et est génétiquement très proche d¹une souche malgache isolée en 1991.

Centre national de référence et Centre collaborateur OMS des arbovirus et des fièvres hémorragiques virales

(H. Zeller, V. Deubel, J. Galabru, D. Coudrier, S. Murri)

Le CNR partage ses activités entre la mise au point de techniques diagnostiques et leur application au diagnostic individuel demandé par les praticiens et à l'étude de l'épidémiologie de certains de ces virus en France et à l'étranger. De plus, Le CNR produit et distribue les réactifs nécessaires au diagnostic des principales arboviroses. Il dispose d'une collection de plusieurs centaines de souches représentant 56 arbovirus et virus des fièvres hémorragiques différents. Un laboratoire de haute sécurité rénové assurera une structure indispensable à la poursuite des missions de veille et d¹expertise des maladies virales émergentes.

Mise au point de techniques

(H. Zeller, V. Deubel, M. Bouloy, C. Prehaud, J. Galabru, D. Coudrier, S. Murri)

Le CNR produit et distribue les réactifs nécessaires au diagnostic des principales arboviroses. Il travaille à l¹amélioration des techniques et au transfert de celles-ci par l¹accueil de stagiaires venant principalement de pays tropicaux. Il dispose d¹une collection de plusieurs centaines de souches représentant 56 arboviroses et virus des fièvres hémorragiques différents. Nous avons développé au profit du laboratoire Pasteur-Cerba le diagnostic sérologique des principales arboviroses par capture d¹IgM. Notre découverte du virus Ebola en Côte d¹Ivoire et au Gabon en 1994 nous a amenés à nous intéresser tant au diagnostic des infections aiguës (IgM, PCR, capture d¹antigène) qu¹aux études de prévalence du portage d¹anticorps. Les protéines recombinantes NP et VP40 de la souche gabonnaise de 1994 du virus Ebola ont été exprimées dans E. coli et purifiées. Utilisées dans un test Elisa, elles permettent de révéler la présence d¹anticorps chez les malades ou dans des échantillons prélevés pour des enquêtes visant à évaluer la circulation du virus. Le diagnostic des affections liées aux hantavirus présents en France repose sur la sérologie. Par contre, l¹étude de la distribution des souches chez les rongeurs a nécessité le développement d¹une technique de PCR. Les protéines d¹enveloppe des 4 sérotypes de la dengue ont été produites par le système du baculovirus et purifiées. Elles sont utilisées pour la détection d¹IgG et d¹IgM. Une trousse de diagnostic préparée par Sanofi-Diagnostic Pasteur pour le diagnostic de la dengue fait l¹objet d¹une validation dans le réseau des Instituts Pasteur.

Epidémiologie

(H. Zeller, V. Deubel, D. Coudrier, S. Murri)

En France existe la fièvre hémorragique avec syndrome rénal, affection due à des Hantavirus, Puumala dans le quart Nord Est et Seoul sur tout le territoire. Une enquête cas/témoins a permis de préciser les facteurs de risque, en particulier de prouver que le campagnol roussâtre, réservoir du virus pénètre dans les habitations situées en lisière de forêt. Le cycle épidémique de cette maladie est directement lié à la dynamique des populations du réservoir. Après les épidémies triennales de 1993 et de 1996, nous observons depuis décembre 1998 une augmentation sensible du nombre de cas de FHSR à virus Puumala. Le Centre exerce une activité de surveillance des arboviroses d¹importation. La dengue est l¹affection la plus courante. Le nombre de cas croit régulièrement en zone tropicale, en particulier dans les Caraïbes. Cette maladie est désormais courante chez les touristes. Nous avons isolé plusieurs souches de ce virus à partir de prélèvements sanguins chez ces patients fébriles. Dans notre rôle de Centre collaborateur OMS, nous avons diagnostiqué et participé à plusieurs épidémies dues au virus West-Nile, un arbovirus transmis d¹oiseaux au cheval et à l¹homme par des moustiques du genre Culex : au Maroc et en Roumanie en 1995, en Tunisie en 1996 puis en Italie en 1998. Ces épidémies font craindre la réapparition de cette maladie dans le sud de la France.

Diagnostic et épidémiologie moléculaire

(H. Zeller, V. Deubel, M. Bouloy, J. Galabru, D. Coudrier, M.T. Drouet, S. Murri)

Plusieurs techniques de diagnostic rapide (RT-PCR) et de caractérisation génétique par séquençage des souches d¹arbovirus et virus des fièvres hémorragiques (Hantavirus, Ebola, FVR, dengue, West Nile, fièvre jaune) ont été mises au point et sont actuellement développées au CNR. Plusieurs de ces études sont réalisées dans le cadre de collaborations avec le Réseau international des Institut Pasteur et Instituts associés.

Mots-clés : Replication, interactions virus cellules, virulence, pathogénèse, épidémiologie moléculaire, diagnostic.

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

MEIGNAN Marie-Laurence Tél : (33) 01 40 61 35 15 MILLIOT Brigitte Tél : (33) 01 40 61 31 45

Chercheurs de l'unité

BILLECOCQ Agnès BOULOY Michèle DESPRES Philippe DEUBEL Vincent FLAMAND Marie GALABRU Julien PREHAUD Christophe ZELLER Hervé

Stagiaires de l'unité

ALCON Sophie - DEA

COULIBALYFasséli -      DEA
COURAGEOT Marie-Pierre  -       Thèse

KOHL Alain - Thèse
SALL Amadou - Thèse
YADANI Fatima - Thèse

Autre personnel de l'unité

MEGRET Françoise - Ingénieur

COUDRIER Daniel - Technicien DROUET Marie-Thérèse - Technicien FRENKIEL Marie-Pascale - Technicien MURRI Séverine - Technicien VIALAT Pierre - Technicien

Publications de l'unité

99048218
99036017
99057243
98175524
98412667
98426883
98456678
98453442
98080483
F. Yadani, C. Préhaud (1998). Les protéines « accessoires » des paramyxovirus. Virologie, 2, 244-246 F. Yadani, C. Préhaud (1998). Glycoprotéines du virus Ebola et processus infectieux. Virologie, 2, 247-248 F. Yadani, C. Préhaud (1998). Cytosquelette et virus à ARN négatifs. Virologie, 2, 249 F. Yadani, C. Préhaud (1998). Réarrangement génique et létalité. Virologie, 2, n° 4, 331-332 V. Deubel, P. Marianneau, M. Flamand, P. Desprès (1998). La dengue hémorragique : données récentes. Association des Anciens Elèves de l¹Institut Pasteur. 154, 9-10 P. Marianneau, M. Flamand, V. Deubel, P. Desprès (1998). Induction of programmed cell death (apoptosis) by dengue virus in vitro and in vivo. Acta Cientifica Venezola, 49, 26-30 V. Deubel (1998). Réflexions sur l¹Actualité : La pathogénie de la dengue hémorragique et du syndrome de choc : données récentes. Bulletin SFM. 13, 223-224 V. Deubel (1998). Les flavivirus et leurs vaccins. Virologie, 2, 51-61 V. Deubel (1998). La dengue : risques et mise au point diagnostique. OPTION/BIO. 147-156 A. Talarmin, D. Hommel, V. Pavec, J.M. Héraud, J. Sarrouy, S. Laventure, F. Fouque, M. Joubert, Y. Seroux, F. Meignant, B. Le Guenno, V. Deubel, J.D. Poveda, A. Hulin, J.L. Sarthou (1998). Fièvre jaune en Guyane : une menace toujours présente. BEH, 39, 170-171 J. Velzing, J. Groen, M.T. Drouet, G. Van Amerongen, C. Copra, A.D.M.E. Osterhaus, V. Deubel (1998). Induction of protective immunity against dengue virus type 2 : comparison of candidate live attenuated and recombinant vaccines. Vaccine, 17, 1312-1320 C. Préhaud, M. Bouloy (1998). Les Bunyaviridae responsables de fièvres hémorragiques. Virologie, 2, 297-304 P. Marianneau, A.M. Steffan, C. Royer, m.T. Drouet, D. Jaeck, A. Kirn, V. Deubel (1999). Infection of primary cultures of human kupffer cells by dengue virus : no viral progeny synthesis, but cytokine production is evident. Journal of Virology, 73, N° 6, 5201-5206

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