Institut Pasteur Rapport d'activité de l'unité Agents Antibactériens


Responsable : COURVALIN Patrice (pcourval@pasteur.fr)

Résumé du rapport

L'Unité des Agents Antibactériens étudie le support génétique, les mécanismes biochimiques, l'expression hétérospécifique, l'évolution et la dissémination de la résistance aux antibiotiques chez les bactéries pathogènes pour l'homme, notamment dans les systèmes suivants : entérocoques et glycopeptides, la résistance chez Neisseria meningitidis et Acinetobacter spp. et le transfert de gènes des bactéries aux cellules de mammifères.

Abstract

The Unit of Antibacterial Agents studies the genetic support, biochemical mechanisms, heterospecific expression, evolution and dissemination of antibiotic resistance in bacterial pathogens for humans; in particular: enterococci and glycopeptides, Neisseria meningitidis and Acinetobacter spp., and trans-kingdom gene transfer from bacteria to mammalian cells.

Texte du rapport

Résistance aux glycopeptides chez les entérocoques (Michel Arthur)

Les entérocoques résistants aux glycopeptides produisent des précurseurs du peptidoglycane terminés par le depsipeptide D-alanyl-D-lactate (D-Ala-D-Lac) qui remplace le dipeptide D-Ala-D-Ala. La résistance requiert trois protéines qui permettent la synthèse du depsipeptide (VanA et VanH) et l'hydrolyse du dipeptide (VanX). Les gènes correspondants sont régulés par des systèmes à deux composants qui activent l'initiation de la transcription en présence de vancomycine et de teicoplanine (phénotype VanA) ou de vancomycine seulement (phénotype VanB). Chaque système comprend un capteur membranaire (VanS ou VanSB) qui contrôle un activateur transcriptionnel (VanR ou VanRB) positivement par phosphorylation et négativement par déphosphorylation. L'activation implique l'autophosphorylation des résidus histidine en position 164 de VanS et 233 de VanSB suivie du transfert des groupements phosphates aux régulateurs partenaires. Les substitutions H164Q et H233Q ont été introduites dans VanS et VanSB afin de supprimer l'activation des régulateurs par phosphorylation. VanSH164Q et VanSBH233Q contrôlaient négativement l'expression des gènes de résistance. Les capteurs modifiés avaient donc conservé une activité phosphatase qui était constitutive pour VanSH164Q et négativement régulée par la vancomycine pour VanSBH233Q. Les capteurs VanSH164Q et VanSBH233Q ne permettaient pas un contrôle négatif des régulateurs hétérologues VanRB et VanR par déphosphorylation. En revanche, le capteur VanS activait VanRB. Une variation clonale de l'expression des gènes de résistance a été mise en évidence chez les mutants de souches de type VanB ne produisant pas VanSB. Ce résultat a été obtenu en construisant une fusion transcritptionnelle entre le promoteur PYB inductible par la vancomycine et le gène gfp codant pour une protéine intrinsèquement fluorescente, permettant ainsi l'analyse de l'expression des gènes de résistance au niveau de bactéries individuelles.

Emergence de la résistance au chloramphénicol chez Neisseria meningitidis (Marc Galimand)

Des souches de Neisseria meningitidis résistantes au chloramphénicol par production d'une chloramphénicol acétyltransférase ont été isolées du liquide céphalorachidien de onze patients au Vietnam et d'un en France. La résistance au chloramphénicol des douze souches était due à la présence, au même site du chromosome, du gène catP localisé dans un transposon tronqué rendu immobile par suite de délétions internes. Le processus de transformation est donc vraisemblablement responsable de la dissémination de la résistance chez cette espèce bactérienne. L'émergence d'une résistance de haut niveau au chloramphénicol chez N. meningitidis est préoccupante; en effet, dans les pays en voie de développement, le chloramphénicol huileux injecté intramusculairement constitue la thérapeutique des méningites à méningocoques.

Résistance de haut niveau aux aminosides chez une souche de Streptococcus du groupe G d'origine humaine (Guy Gerbaud)

Les concentrations minimales inhibitrices de la gentamicine, de la kanamycine, de l'amikacine et de la streptomycine vis-à-vis de la souche de Streptococcus du groupe G BM2721 sont supérieures à 1000 mg/L. Cette résistance de haut niveau est due à la présence des gènes aac(6')-aph(2"), aph(3')-IIIa et ant(6)-Ia qui codent pour des aminosides acétyltransférase, phosphotransférase et adénylyltransférase. Ces gènes sont localisés sur un élément génétique résultant d'un évènement de recombinaison entre la partie gauche du transposon Tn5405 qui porte les gènes aph(3')-IIIa et ant(6)-Ia et la partie droite de Tn4001 qui porte le gène aac(6')-aph(2"); ces deux transposons sont répandus chez Staphylococcus spp. Le haut niveau de résistance de Streptococcus BM2721 à tous les aminosides disponibles est cliniquement important car l'association de b-lactamines et d'aminosides est nécessaire au traitement des infections sérieuses dues à ces microorganismes, telles les endocardites ou les septicémies, chez des patients neutropéniques.

Nouveaux caractères de résistance aux glycopeptides chez les entérocoques (Bruno Périchon)

Les souches cliniques de Enterococcus faecium BM4339 et BM4416 présentent un phénotype inhabituel de résistance constitutive et non transférable aux glycopeptides, VanD (CMI à la vancomycine = 64 et 128 mg/ml ; CMI à la teicoplanine = 4 et 64 mg/ml, respectivement). L'organisation des gènes de l'opéron vanD est similaire à celle des opérons vanA et vanB. De façon surprenante, ces deux souches possèdent une mutation par insertion (5 pb pour BM4339 et environ 1 kb pour BM4416) dans le gène de la D-Ala:D-Ala ligase qui rend cette enzyme non fonctionnelle. L'insertion-inactivation a été confirmée par l'analyse des précurseurs du peptidoglycane qui montre la synthèse exclusive de précurseurs terminés en D-alanine-D-lactate. La souche clinique de E. faecalis BM4405, résistante à la vancomycine (CMI = 16 mg/ml) et sensible à la teicoplanine (CMI = 0,5 mg/ml), présente également un phénotype de résistance nouveau, VanE. Les résultats préliminaires montrent que l'opéron vanE est similaire à vanC, spécifique de E. gallinarum, E. casseliflavus et E. flavescens ; ce qui rend compte des résultats de l'analyse des précurseurs du peptidoglycane qui indiquent la synthèse quasi-exclusive (90%) de précurseurs terminés par D-alanine-D-serine. La caractérisation de l'opéron vanE est en cours.

Transfert de gènes des bactéries aux cellules de mammifères (Catherine Grillot-Courvalin)

Certaines espèces bactériennes ont la capacité de pénétrer les cellules de mammifères en induisant leur propre internalisation. Nous avons montré que des souches de Escherichia coli, rendues invasives et capables de lyser après leur entrée dans les cellules de mammifères par défaut de synthèse de la paroi bactérienne, sont capables de délivrer de l'ADN exogène plasmidique qui s’exprime dans ces cellules. Ce transfert direct de matériel génétique est efficace, à large spectre d'hôte et les vecteurs réplicatif ou intégratif ainsi délivrés sont hérités de façon stable et exprimés par la progénie des cellules qu'elles se divisent ou non. L'ADN délivré par l'invasion abortive de cellules eucaryotes par les bactéries présente un intérêt pour la stimulation de l'immunité mucosale et pour la thérapie génique humaine in vivo ou ex vivo.

Résistance aux antibiotiques chez Acinetobacter spp. (Thierry Lambert)

Une étude systématique de la distribution des 6’-aminoside acétyltransférases [AAC(6’)-I] chez Acinetobacter spp. a montré que toutes les souches appartenant aux espèces protéolytiques hébergent naturellement des gènes spécifiant ces enzymes. Ces gènes sont phylogénétiquement apparentés et localisés sur le chromosome. Ils confèrent, en général, une résistance de faible niveau. Nous avons également montré, chez une souche appartenant à l’espèce 13, qu’un gène aac(6’)-I silencieux pouvait être activé par la transposition de IS18 qui génère un promoteur hybride permettant la transcription du gène. La détection des gènes aac(6’)-I par amplification (PCR) permet l’identification rapide des espèces protéolytiques, très difficilement distinguables sur la base des caractères biochimiques.

Centre National de Référence des Antibiotiques

Les principales fonctions du Centre National de Référence des Antibiotiques sont l’étude de la prévalence de la résistance aux antibiotiques chez les genres bactériens pathogènes pour l’homme, le maintien des collections de souches bactériennes de référence, de sondes nucléiques et de gènes de résistance, l’évaluation de l’activité in vitro des antibiotiques nouveaux, l’évaluation et l’amélioration d’appareils ou de techniques de détection de la résistance bactérienne aux antibiotiques ou de mécanismes de résistance et la mise au point de techniques de référence de détection des mécanismes de résistance.

Personnel de l'unité

Secrétariat de l'unité

NAGEL Françoise
VAN STEENKISTE Pascale

Chercheurs de l'unité

ARTHUR Michel, IP
GALIMAND Marc, IP

Stagiaires de l'unité

ABADIA Lorena, Thèse Sciences
ASLANGUL Elisabeth, Thèse Sciences
AUBRY-DAMON Hélène, DEA
BARROS BAPTISTA Marina, Thèse Sciences
CAO Thi Bao Van, Thèse Sciences
CANTOR Michael, Etudiant en Médecine
CARNAHAN Robert, Thèse Sciences
CASADEWALL Barbara, Thèse Sciences
FINES Marguerite, DEA
GARNIER Fabien, Thèse Sciences
GHOLIZADEH Yasmine, Docteur en Médecine GRILLOT-COURVALIN Catherine, Directeur de Recherche CNRS MAGNET Sophie, Thèse Sciences
OZAWA Yoshiyuki, Post-doc
VIJAYAKUMAR Moses, Professeur invité

Autre personnel de l'unité

CHARLES Murielle, IP
DEPARDIEU Florence, IP
GERBAUD Guy, IP
GOUSSARD Sylvie, IP
PERICHON Bruno, IP

Publications de l'unité

MEDLINE Identifiers:
98443483
98443450
98443445
98414053
98417097
98414370
99140440

Epidemiology and mechanisms of resistance among respiratory tract pathogens. Baquero, F., J.F. Barrett, P. Courvalin, I. Morrissey, L. Piddock, and W.J. Novick. Clin. Microb. Infect. 4 : 2S19-2S26.

Quality assessment of glycopeptide susceptibility tests: A european collaborative study. Brown, D.F.J., P. Courvalin, and the European Glycopeptide Resistance Group. Int. J. Antimicrob. Agents 9 : 153-163.

Plantes transgéniques et antibiotiques. Courvalin, P.
La Recherche 309 : 36-40.

Gene transfer from bacteria to mammalian cells. Courvalin, P., S. Goussard, and C. Grillot-Courvalin. pp. 107-117. In M. Syvanen and C.I. Kado (ed.), Horizontal Gene Transfer. Chapman and Hall, London.

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