Activité scientifique

Virologie et Sida

Molécules et structures

Biologie moléculaire de la cellule eucaryote

Génétique et biologie du développement

Génomes Immunologie et immunopathologie

Bactéries et champignons pathogènes

Neurobiologie et neuropathologie

Parasites et parasitologie

Physiologie microbienne et environnement

Virologie et Sida

L'étude des virus est ancienne à l'Institut Pasteur. Son développement actuel est directement lié à l'importance, en termes de santé publique, de l'infection par de nombreux virus ainsi que par la place des viroses parmi les maladies émergentes.

Le virus de l'immunodéficience humaine (VIH)

Relations entre l'hôte et le VIH

Qu'une zoonose soit à l'origine de l'infection par le VIH est rendu plus probable encore avec la découverte de virus de chimpanzés très proches des VIH1 du groupe N, présents dans la même région d'Afrique.

La relation entre l'hôte et le VIH varie selon les individus. Certains sujets restent séronégatifs malgré leur exposition fréquente au virus. C'est le cas en Afrique Centrale et en Asie du Sud-Est. Ces sujets font l'objet d'études pour identifier les marqueurs qui pourraient être associés à une protection naturelle.

La réplication du VIH et la survie des cellules infectées chez l'homme dépendent de facteurs sécrétés comme le TNF dans le thymus et l'IL7, essentiels pour la survie des cellules infectées. Des facteurs placentaires interviennent dans le contrôle de la transmission du VIH-1 mère - enfant in utero.

Les voies d'entrée du VIH dans les cellules cibles sont encore trop mal connues. Les particules virales interagissent d'abord avec les sulfates d'héparanes et la nucléoline de surface, puis avec CD4 et les récepteurs de chimiokines. L'infection pourrait être ralentie en agissant sur l'accrochage du virus.

De fait, un pseudopeptide bloque efficacement l'infection du VIH-1 en se fixant sur la nucléoline. Une cytokine, Midkine, interagit également avec la nucléoline de surface et inhibe l'accrochage des particules virales. Midkine pourrait être un élément de défense naturel contre le VIH. Les chimiokines contrôlent l'entrée du virus dans les cellules. La chimiokine SDF-1, qui lie et internalise in vitro le co-récepteur viral CXCR4, limite la contamination par le VIH au niveau des muqueuses. SDF-1, produit de manière permanente par les cellules des muqueuses, provoque l'internalisation de CXCR4 par les lymphocytes locaux et minimise ainsi l'entrée du virus. En outre, SDF-1 arrête en moins d'une seconde la sortie des lymphocytes hors des vaisseaux sanguins en augmentant brutalement l'avidité des leucocytes pour la molécule d'adhésion VCAM-1.

Réponse immunitaire et vaccins contre le sida

Pour qu'un vaccin contre le sida soit possible, il faut d'abord déterminer si les cellules infectées peuvent être tuées par des lymphocytes T spécifiques du virus (LTC). Ces cellules reconnaissent de petits fragments de protéines virales, ou épitopes, présentés par des molécules d'histocompatibilité de classe I. Des lignées de souris exprimant des molécules humaines à la place de leurs molécules présentatrices ont été produites. Les lymphocytes T de ces animaux reconnaissent avec une grande efficacité les molécules humaines chargées d'épitopes viraux. Cette approche maintenant validée pour les molécules de classe I est étendue aux molécules d'histocompatibilité de classe II nécessaires au maintien au long cours des réponses antivirales. Les cellules spécialisées dans la présentation d'antigènes viraux pourraient jouer un rôle notable dans l'activation des lymphocytes T cytotoxiques en utilisant des protéines virales, ce qui conduit à une réponse immune en l'absence de réplication virale.

Il faut ensuite comprendre pourquoi le VIH échappe au système immunitaire.

L'activation spécifique de cellules T stimule la réplication virale dans les cellules T auxiliaires ce qui se traduit par une production accrue de virus. La propagation de l'infection est le produit d'une différence de cinétiques : le virus est fabriqué en moins de 24 heures. Le site de production de virus est ensuite “nettoyé“ par des lymphocytes cytotoxiques. Mais, comme le virus a pris de l'avance sur la réponse immunitaire, l'infection ne peut être éradiquée. Les protéines du virus ne sont donc pas dotées de propriétés singulières qui permettraient au virus de s'échapper. Le contrôle de la prolifération virale par les cellules cytotoxiques est ainsi la résultante de mécanismes dont le nombre est plus important qu'on ne le supposait, d'autant que la protéine Nef du VIH-1 diminue l'expression des molécules d'histocompatibilité par les cellules infectées, protégeant ainsi ces dernières contre la cytotoxicité.

Tout ceci permet cependant d'envisager des essais de vaccination chez les primates non-humains. L'infection de macaques par le SIV, puis par le virus hybride SHIVsbg - correspondant à du SIV dans lequel l'enveloppe a été remplacée par celle du VIH-1 -, est un bon modèle de l'infection humaine, utilisé pour définir un vaccin contre les protéines d'enveloppe hybrides. Une autre stratégie vaccinale repose sur un vaccin vivant atténué constitué de virus de la rougeole recombinant, destiné à vacciner contre HTLV-1, contre le virus de l'immunodéficience simienne (VIS) et ultérieurement contre le VIH.

En attendant, la chimiothérapie prévaut. Les analogues de nucléosides utilisés dans les thérapies antivirales et notamment anti-VIH doivent être modifiés par le receveur : leur phosphorylation, qui conduit au dérivé triphosphate actif sur la transcriptase inverse du virus, est catalysée par les kinases cellulaires, mais constitue une étape limitante. On s'intéresse à la mise au point de molécules dérivées de ces composés par l'introduction d'un groupe borane, meilleurs substrats que les analogues non-substitués et partiellement actifs sur des transcriptases inverses mutantes, résistantes à l'AZT. L'étude de leurs effets cellulaires est en cours. Des études concernent enfin la reconstitution immunologique chez les patients infectés par le VIH et traités par trithérapie antivirale, en particulier chez des enfants recevant des traitements antirétroviraux combinés. Ces connaissances sont utiles pour la définition de protocoles de vaccination et d'immunothérapie.

Virus HTLV-1

Le HTLV-1 est un rétrovirus humain agent de la paraparésie spastique tropicale, une maladie neurologique qui ressemble à la sclérose en plaques, et de la leucémie aiguë à cellules T de l'adulte, maladies endémiques dans la région Caraïbe, en Afrique centrale et au Japon. Il n'existe pas de modèle animal adéquat pour étudier l'infection à HTLV-1. Plusieurs tentatives ont été faites pour obtenir un modèle à l'aide de souris transgéniques. Un virus chimérique ayant acquis un tropisme pour les cellules murines a été construit avec l'espoir d'obtenir une maladie modèle chez la souris.

Des études d'épidémiologie moléculaire des virus HTLV-1/2 et des virus simiens apparentés STLV sont poursuivies. Plus de 30 nouvelles souches de STLV-1, originaires d'Afrique ou d'Asie du Sud- Est ont été séquencées. La séquence complète d'un nouveau virus de type PTLV-L, particulièrement divergent, a été réalisée. Une vaste étude épidémiologique de HTLV-2 a été effectuée dans différentes populations vivant en zones forestières au Cameroun.

Virus herpétiques humains

La variabilité du virus HHV8, dont l'infection est associée au sarcome de Kaposi et à d'autres syndromes lymphoprolifératifs est également étudiée. De nouveaux variants d'HHV8 et de 2 sous-types ont été mis en évidence chez des patients d'origine africaine, tandis qu'en Afrique de nouveaux isolats fortement apparentés à HHV8 étaient trouvés chez des gorilles et des chimpanzés. Ces résultats permettent de formuler des hypothèses quant à l'origine, à l'évolution et aux voies de dissémination de ces virus.

Virus des hépatites A, B et C

La traduction efficace des ARN messagers des virus des hépatites A, B et C nécessite leur circularisation physique par des protéines. Bien que ce phénomène soit conservé pour tous les virus, les protéines peuvent être différentes. Pour le virus de l'hépatite C, l'inhibition de la circularisation des ARN représente une cible antivirale potentielle de choix.

Les travaux sur le virus de l'hépatite A ont conduit à proposer un modèle pour le découpage et l'assemblage des protéines de capside, qui diffère du modèle antérieur.

Du côté de l'hépatite B, une étape clef dans l'infection virale est l'interaction entre la protéine régulatrice X du virus et une protéine de la cellule hôte, UV-DDB. Cette interaction fournit une nouvelle cible pour le développement de médicaments antiviraux. En utilisant des souris transgéniques pour l'antigène de surface du virus VHB (AgHBs), un modèle d'immunothérapie par vaccination génétique devient accessible. Différentes manœuvres permettent de lever la tolérance à l'AgHBs, d'induire l'élimination sérique du virus et de contrôler l'expression des gènes viraux dans le foie des souris. Des souris “humanisées” ont été vaccinées avec des plasmides codant pour les protéines d'enveloppe du VHB. Une réponse spécifique d'épitopes identiques à ceux reconnus par les lymphocytes T de patients a été obtenue. Ces résultats valident la vaccination génétique comme outil thérapeutique potentiel chez les porteurs chroniques. Un essai clinique de phase I devrait être prochainement lancé. Chez des patients chroniquement infectés par le virus de l'hépatite C, la nucléocapside du virus a été mise en évidence dans le sérum des patients. Cette découverte peut être importante pour la compréhension de la physiopathologie de l'infection ainsi que pour son diagnostic.

Comme il n'existe pas de modèle animal autre que le chimpanzé, on envisage de se servir d'un petit primate comme modèle animal de substitution. Pour ce faire, des virus chimères très proches du virus de l'hépatite C sur le plan moléculaire, hépatotropes et se multipliant à hauts titres chez le singe tamarin, ont été construits.

Virus de la grippe et virus des voies respiratoires

Lors de la saison 1999-2000, l'épidémie de grippe a été particulièrement intense avec un nombre de personnes infectées estimé à 8,8 millions en France.

Le pourcentage de prélèvements positifs pour la grippe A a été près de deux fois plus élevé qu'entre 96 et 99. L'épidémie s'est caractérisée par la circulation pratiquement exclusive de virus grippaux A(H3N2), dont les caractéristiques se sont révélées en bon accord avec la composition vaccinale. De nouvelles formes vaccinales sont recherchées. Des chimères dérivées du virus de la Forêt de Semliki, permettant l'expression de la nucléoprotéine du virus grippal, ont été construites et injectées sous forme d'ARN nu à la souris, provoquant une immunité cellulaire protectrice. Il en est de même avec une chimère dérivée du Mengo virus.

La spécificité d'espèce des virus grippaux est notamment déterminée par la spécificité de l'hémagglutinine virale vis-à-vis de son récepteur, l'acide sialique. Des déterminants impliqués dans la capacité de l'hémagglutinine H3 à agglutiner les hématies de coq ou de mouton sont en relation avec la nature de la liaison de l'acide sialique aux composants de la surface des hématies. La transmission entre espèces des virus grippaux aviaires est susceptible d'être à l'origine de nouvelles pandémies de grippe. Une sensibilité thermique, due aux protéines PB2 et PA du complexe polymérase a été mise en évidence pour les virus grippaux d'origine aviaire mais non pour les virus humains. La sensibilité du complexe à 33°C, température proche de celle du tractus respiratoire supérieur des mammifères, pourrait contribuer à la moindre multiplication des virus grippaux aviaires chez l'homme.

L'infection du veau par le virus respiratoire syncytial bovin, un modèle très proche de l'infection de l'enfant par le virus humain, a été étudiée. En Europe, les isolats du virus bovin subissent une pression de sélection positive sur la glycoprotéine, en particulier dans les pays qui pratiquent la vaccination. Des isolats présentant des modifications importantes de la glycoprotéine ont été récoltés. Cette rapidité d'évolution pose des problèmes de conception des vaccins bovin et humain.

Arboviroses, dengue, virus West Nile et fièvres hémorragiques

L'expression des protéines du virus de la dengue dans des cellules cibles est étudiée. La glycoprotéine d'enveloppe E et l'hélicase virale à ARN modulent la mort cellulaire en réponse à l'infection virale. L'inhibition de la maturation des glycoprotéines de l'enveloppe du virus empêche l'assemblage de la particule virale. Du fait de différences dans la glycosylation, la sécrétion de la glycoprotéine NS1 du virus est observée chez les mammifères et non chez le moustique vecteur. La protéine NS1 détectée dans le sang des personnes infectées, devient ainsi une cible pour un diagnostic précoce de la maladie.

L'importance de la dengue en tant que maladie d'importation en France est faible. Ce n'est pas le cas en zone tropicale. Omniprésent dans cette zone, aedes aegypti est le vecteur principal du virus de la dengue. Des interactions complexes le lient aux espèces indigènes et, notamment, à aedes albopictus. L'étude de l'organisation génétique des populations met en évidence comment les bouleversements liés à l‘homme retentissent sur les populations d'Aedes puis sur l'épidémiologie de la dengue. Les résultats relatifs aux populations de la Guyane française, de Madagascar, de l'Île de la Réunion, du Cambodge, du Viêt-nam et de Côte d'Ivoire sont disponibles et des marqueurs génétiques applicables aux études de génétique des populations ont été définis.

Depuis sa découverte en 1937 en Ouganda, le virus West Nile a été isolé dans plusieurs pays d'Afrique, d'Europe, du Moyen Orient, d'Asie, et récemment aux États-Unis. Deux groupes de virus génétiquement différents circulent en Afrique mais seul un d'entre eux est responsable d'épidémies associant des encéphalites chez l'homme et le cheval. La souche introduite aux États-Unis en 1999 est génétiquement très proche de la souche circulant en Israël depuis 1997. Le virus West Nile est réapparu en France fin août 2000 dans le Languedoc sous forme d'une épizootie chez des chevaux, en l'absence de cas humains confirmés. Une étude au niveau des populations aviaires, hôtes amplificateurs du virus, a été entreprise.

Le virus de la fièvre de la vallée du Rift est responsable de fièvres hémorragiques chez l'homme, d'avortements et malformations fœtales chez les ruminants. Depuis septembre 2000, le virus est sorti du continent africain et a provoqué une dramatique épidémie en Arabie Saoudite et au Yémen avec de nombreux cas humains. Les travaux sur ce virus ont montré qu'une protéine non structurale (NSs) du virus joue un rôle majeur comme facteur de virulence en bloquant la production d'interféron. Un mutant naturel, qui possède une NSs défective, est avirulent. Réseau international Recherche Enseignement Santé

Virus de la rage et Lyssavirus

L'épizootie vulpine est en régression en Europe de l'Ouest, laissant la place à celle des chauves-souris insectivores. Des cas d'infection asymptomatique ont été identifiés chez des chauves-souris frugivores de parcs zoologiques. L'importation d'animaux enragés, infectés notamment par des lyssavirus différents du virus de la rage, semble se confirmer au niveau européen. Ces lyssavirus posent un problème de santé publique car les vaccins antirabiques ne sont pas, ou sont peu efficaces, contre eux, de même que les immunoglobulines.

Un élargissement du spectre de protection des vaccins antirabiques à tous les lyssavirus est possible en immunisant avec des gènes codant des glycoprotéines chimères, et l'efficacité chez le chien de la vaccination par de l'ADN nu a été démontrée. En matière de production de vaccins, il a été montré que les corps apoptotiques des lymphocytes infectés par le virus rabique étaient de puissants immunogènes.

Virus de la poliomyélite

La surveillance virologique requise pour l'éradication de la poliomyélite a permis de mettre en évidence, dans un pays où le vaccin antipoliomyélitique oral est utilisé, la présence dans les eaux usées de souches de poliovirus dérivées du vaccin, hautement mutées et ayant acquis un phénotype très neurovirulent. Des poliovirus ayant recombiné à des sites préférentiels entre des souches sauvages et atténuées ont été isolés et caractérisés.

Une étude de taxonomie moléculaire des entérovirus a été entreprise afin de créer un nouvel instrument taxonomique. Bien que le poliovirus ne persiste en général pas chez l'homme, les infections chroniques parfois asymptomatiques de patients immunodéficients compliquent le problème de l'éradication de la poliomyélite. L'étude de poliovirus persistant dans l'intestin de certaines personnes immunodéficientes a été abordée.

Virus et cancer

Chez des patientes qui connaissent une immunodépression sévère due au VIH, une néoplasie intra-épithéliale du col utérin associée à l'infection productive par un papillomavirus oncogène est assez fréquente. La tri-thérapie antirétrovirale a un effet positif sur la maladie du col de l'utérus.

Chez le lapin, les verrues et les cancers provoqués par un papillomavirus ont permis de montrer le rôle crucial joué par le couple histocompatibilité/ variabilité de certaines régions du génome viral, dans l'évolution des lésions causées par un papillomavirus oncogène vers la régression ou la transformation maligne.

L'épidermodysplasie verruciforme, maladie associée à un risque élevé de cancer cutané, se caractérise par une sensibilité anormale à un papillomavirus oncogène, le PVH5. Deux loci chromosomiques de prédisposition à cette maladie ont été identifiés. Les patients atteints de psoriasis constituent un réservoir du PVH5 et l'importance d'une prolifération intensive des kératinocytes dans le démasquage des infections latentes par le PVH5 a été mise en évidence.

Les porteurs chroniques du virus de l'hépatite B (VHB) courent un risque élevé de développer un cancer du foie. Il a été montré dans un modèle de souris transgéniques que le gène régulateur X du VHB joue un rôle de cofacteur dans l'induction de tumeurs hépatiques. On étudie les mécanismes par lesquels le gène X contrôle le cycle cellulaire. Par ailleurs, un oncogène cellulaire, la b-caténine, est fréquemment muté et activé dans le cancer du foie.

De nouvelles protéines partenaires de la b-caténine ont été identifiées. Une étude comparative des anomalies chromosomiques dans l'hépatocarcinome chez l'homme et la souris devrait permettre de mettre en évidence des mécanismes communs de transformation et fournir de nouveaux marqueurs pour le dépistage précoce des tumeurs. L'inactivation de gènes suppresseurs de tumeur est d'importance majeure dans le développement des cancers humains. Ceci justifie que l'on tente d'identifier des gènes suppresseurs associés au cancer du foie et de remettre les cellules sur la voie d'une différenciation normale.

Dérivés de virus et thérapie génique

La thérapie génique consiste à introduire et à faire exprimer des gènes étrangers dans des cellules d'un tissu choisi pour corriger un déficit génétique. Les outils utilisés sont souvent dérivés de virus qui possèdent naturellement la capacité d'introduire leur matériel génétique dans des cellules étrangères. La modification des génomes viraux permet de vectoriser l'ADN thérapeutique. Des vecteurs dérivés du VIH-1 ont été mis au point. Ils ont été suffisamment efficaces pour être utilisés en clinique humaine.

L'évaluation de stratégies pour la thérapie génique chez l'homme passe par les modèles animaux. Deux modèles sont travaillés. Les maladies de surcharge lysosomale sont rares, mais dramatiques chez les jeunes enfants chez qui elles atteignent principalement le cerveau. Des stratégies de correction du déficit dans le système nerveux ont été mises au point avec des vecteurs dérivés du VIH ou de parvovirus chez des souris modèles. Elles sont maintenant évaluées chez des mammifères de grande taille.

La ß-thalassémie est à l'inverse extrêmement répandue dans le monde. Des stratégies de correction reposant sur l'expression de l'érythropoïétine dans le muscle ont été décrites. Le but est d'obtenir la ré-expression des chaînes d'hémoglobine fœtale en réponse à la stimulation par l'érythropoïétine.

Molécules et structures

Les études sur les protéines gagnent en importance, tandis que la chimie organique prend une place croissante dans la conception d'analogues de molécules biologiques.

Conception, amélioration et production de macromolécules d'intérêt biologique et médical

Le but est de construire de nouvelles protéines thérapeutiques et une nouvelle génération d'outils analytiques et diagnostiques. L'affinité, la spécificité et la stabilité de protéines sont ainsi modifiées à la demande par mutagenèse dirigée, pour comprendre sur quoi reposent leurs propriétés et pour en améliorer l'usage. Des biocapteurs optiques capables de doser un antigène de façon continue sont en préparation.

Les anticorps murins ou humains sont des réactifs essentiels à la recherche biomédicale. L'accent est ici mis sur la production et la caractérisation d'anticorps impliqués dans les maladies auto-immunes et capables de neutraliser des micro-organismes ou des toxines. Ce volet est complété par la sélection d'anticorps sur des antigènes aléatoires réalisant une sorte de biochimie combinatoire des antigènes. Une attention particulière est portée aux anticorps anti- ADN dans le lupus érythémateux diffus.

Des protéines d'intérêt médical, surtout la protéine d'enveloppe du virus de la fièvre jaune et la glycoprotéine E du virus de la dengue-2, sont produites en quantité par des cellules d'insectes recombinantes, ainsi que le peptide pro-apoptotique du virus de la dengue-1. La glycoprotéine du virus West Nile est produite à des fins de diagnostic tandis que la protéine membranaire prM et la glycoprotéine E de ce même virus le sont à des fins vaccinales.

Repliement des protéines

Comprendre la manière dont les protéines se replient correctement permet d'améliorer la production de protéines et surtout de comprendre des “erreurs“ de repliement des protéines responsables de maladies comme les maladies à prions. C'est ainsi que les intermédiaires de repliement de certaines protéines qui apparaissent dans les premières millisecondes suivant la synthèse sont étudiés. Le repliement des protéines exportées par les bactéries est la clef de productions biotechnologiques. Le contrôle de qualité du repliement (détection, réparation et dégradation de protéines mal repliées) est analysé sur un mutant d'une protéine de l'enveloppe bactérienne qui présente un défaut de repliement. Ceci a permis de comprendre le rôle de deux autres protéines d'enveloppe dans cette mécanique. Il est essentiel de calculer l'effet de mutations sur l'énergie d'association et le repliement des protéines. Une méthode de calcul a été validée sur des mutants d'une protéine bactérienne de résistance à un antibiotique.

Structure et interactions des macromolécules

Ce domaine de la recherche exige des équipements lourds, dont l'installation est une priorité pour l'Institut. La structure de nombreuses macromolécules est en cours d'étude. La détermination de structures tridimensionnelles par diffraction des rayons X de cristaux de macromolécules a gagné en ampleur. L'étude structurale et fonctionnelle des nucléoside monophosphate kinases procaryotes, cibles potentielles en thérapie antibactérienne a été poursuivie. Plusieurs UMP kinases de bactéries pathogènes ont été cristallisées : les essais de cristallisation de l'UMP kinase de Mycobacterium tuberculosis sont prometteurs. L'enzyme serait un trimère de dimères dont chaque sous-unité est située dans le même plan. Ce modèle a permis aussi de définir les sites d'interaction avec les différents ligands. La structure 3D de la CMP kinase d'Escherichia coli, co-cristallisée avec ses ligands et analogues, a mis en évidence les liaisons entre la protéine et ses substrats. Enfin, l'effet inhibiteur de certains analogues de nucléosides, observé sur la TMP kinase de M. tuberculosis dont la structure 3D vient d'être résolue, ouvre de nouvelles perspectives pour la recherche d'agents antibactériens.

La Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) est utilisée pour étudier les relations structure : fonction des molécules biologiques, ainsi que les problèmes de reconnaissance moléculaire du type DNA-protéine, protéine-protéine ou encore peptide-macromolécules..

L'étude par RMN de la structure de la protéine porteuse d'hème de Serratia marcescens est terminée. Elle montre un mode de repliement nouveau pour une protéine fixant l'hème.

La structure de toxines de venin de scorpion spécifiques des canaux sodium ou potassium permet de comprendre leur action particulière à chaque espèce.

D'autres études portent sur les interactions protéine-protéine et protéine- ADN et ont permis de mettre en évidence de nouveaux types de repliements.

Enfin, les recherches sur l'utilisation des sondes à très faible volume sont poursuivies en particulier pour étudier des microbes qui se divisent peu.

Peignage de l'ADN

Le peignage moléculaire est une méthode d'alignement de molécules d'ADN qui consiste à fixer par une extrémité sur une surface de verre traitée des molécules d'ADN en solution puis à les étirer régulièrement. Après la disparition complète de la solution, les molécules d'ADN sont alignées et étirées régulièrement, comme si elles avaient été peignées.

Outre la cartographie physique des génomes et le diagnostic de maladies génétiques, cette méthode relativement simple ouvre des perspectives en cancérologie. En effet, il a été montré qu'elle peut s'appliquer à la détection de phénomènes survenant au cours de la cancérisation d'une cellule : microdélétions, inversions ou amplifications de gènes.

Au-delà de ces applications, le peignage moléculaire permet d'aborder sous un angle tout à fait nouveau la réplication de l'ADN chez les eucaryotes. L'identification et la définition moléculaire d'une origine de réplication restent en effet un défi fondamental. Le peignage moléculaire permet d'étudier l'organisation des unités de réplication et de déterminer leur distribution dans le génome et leur activité lors de la division cellulaire, et donc de réaliser une analyse systématique du contrôle de la réplication.

L'établissement d'une carte physique à haute résolution des origines de réplication dans la levure de bière est en cours. Une étude semblable est débutée chez le xénope.

Synthèse organique

Les travaux en chimie organique sont à l'interface de la chimie et de la biologie.

L'axe “vaccins synthétiques“ vise à comprendre la réponse immunitaire contre Shigella flexneri en se servant de sucres complexes synthétiques comme antigènes. La ramification de ces sucres est l'élément clé de la reconnaissance par les anticorps. Un nouveau type d'immunogène, constitué d'un cœur de lysines portant plusieurs copies de l'antigène tumoral Tn et un épitope peptidique, a été synthétisé et utilisé comme vaccin antitumoral en expérimentation clinique.

La synthèse de ligands peptidiques permet d'étudier les interactions entre ses récepteurs et le virus du SIDA, et de rechercher des antagonistes interférant avec ce mécanisme. Par ailleurs, des dérivés a-boranophosphate de nucléosides ont été préparés pour le développement d'antiviraux actifs contre les souches résistantes du VIH.

Différentes prodrogues susceptibles de pallier le problème du passage des molécules au travers des membranes ont été synthétisées, ainsi que des analogues de la ribavirine contre le virus de la dengue. On cherche aussi à élargir la gamme des acides nucléiques qui peuvent être répliqués in vitro ou in vivo. Un procédé combinatoire de synthèse permet d'engendrer une collection de nucléoside triphosphates soumis à des tests d'incorporation par des ADN polymérases et permettant de cribler des monomères doués de capacité d'appariement univoque ou ambigu et/ou des inhibiteurs de réplication. Une deuxième modification concerne le squelette phosphopentose : des mimes d'acides nucléiques, où le sucre est constitué d'un cycle à six atomes, sont reconnus par les ADN polymérases et peuvent transférer l'information génétique in vivo. Le groupe d'évolution dirigée des enzymes, applique une stratégie darwinienne à des populations de protéines pour isoler des catalyseurs spécifiques de réactions chimiques données. L'expression d'ADN-polymérases ADN-dépendantes a été ainsi améliorée et la sélection in vitro de nucléotidyltransférases en fonction de leur activité catalytique a été réalisée.

Dans le domaine essentiel des puces à ADN, la mise au point des méthodes de greffe covalente en 3' et en 5' d'oligonucléotides présynthétisés, sur un support de lame de verre silanisé, se poursuit.

Biologie moléculaire de la cellule eucaryote

L'établissement de la séquence quasi complète du génome humain par un consortium international, constitue une avancée scientifique majeure. Néanmoins, cette information n'explique pas comment les produits de nos gènes déterminent notre développement et le fonctionnement postnatal de notre organisme, ni les mécanismes qui régulent l'expression de nos gènes (ou transcription) dans le temps et dans l'espace, en réponse à des signaux internes ou externes. Les séquences régulatrices de gènes sont reconnues par des facteurs de transcription, des protéines affines à l'ADN, qui constituent elles-mêmes environ 6 % de nos gènes. L'ADN est empaqueté dans une chromatine constituée d'unités répétitives, les nucléosomes, dans lesquels il est enroulé autour d'un octamère d'histones. De nombreuses études ont montré que l'accessibilité des facteurs de transcription aux gènes est restreinte par la structure chromatinienne. Des modifications covalentes des histones ainsi que des machineries de remodelage de la chromatine devraient ainsi moduler l'activation ou la répression des gènes. Autrement dit, les processus tels que la transcription ou la réplication ne sont pas localisés de façon aléatoire dans l'espace nucléaire, mais s'effectuent à des positions topologiques données.

Facteurs de transcription et contrôle de l'expression des gènes

Pour la première fois, l'organisation structurale d'un sous-domaine nucléaire, le domaine périnucléaire de répression transcriptionnelle, a pu être caractérisée. En effet, il a été montré, d'une part, que l'intégrité structurale de ce domaine est responsable de l'ancrage et de l'immobilisation de facteurs inhibant la transcription et que, d'autre part, la localisation relative d'un gène par rapport à ce type de domaine contribue à la régulation de son expression. Ainsi, les cellules utiliseraient l'architecture intranucléaire pour coder de l'information épigénétique.

Plusieurs sous-unités des complexes de remodelage de la chromatine sont étudiées : l'une d'elles est essentielle au développement très précoce de la souris. En son absence, des blastocystes sont formés mais leur implantation échoue. Les souris hétérozygotes sont viables mais développent des tumeurs, ce qui suggère que ce gène peut être un gène suppresseur de tumeur.

Un certain nombre de gènes impliqués dans des fonctions hépatiques, rénales et pancréatiques sont régulés par deux homéoprotéines HNF1a et HNF1b. Un des gènes hépatiques affecté par l'absence de HNF1 a est la phénylalanine hydroxylase, dont l'absence entraîne une phénylcétonurie. Son extinction est associée à la formation d'une structure chromatinienne inactive et à la persistance de la méthylation du gène. La présence d'HNF1 a est essentielle dans une fenêtre de temps précise au cours du développement. En son absence, une structure inactive de la chromatine est formée, incapable de répondre au facteur de transcription. Des mutations d'HNF1 a chez l'homme et chez la souris, sont associées à un diabète familial de type II. Les souris déficientes présentent aussi des défauts rénaux de réabsorption du glucose et l'examen de sujets humains a révélé de tels défauts, non décelés auparavant.

L'inactivation spécifique de gènes chez la souris est un moyen puissant de d'étudier le fonctionnement de gènes. Sur cinq gènes inactivés, seuls deux d'entre eux entraînent une létalité embryonnaire. La fonction des autres gènes est importante pour la vie postnatale. L'analyse de ces souris permet d'approfondir les connaissances sur les régulations fines du fonctionnement des cellules et organes. Cette approche est utilisée pour définir l'activité des facteurs de transcription. Ainsi, la protéine junD, une des sous-unités du facteur de transcription AP1, est important pour la spermatogenèse et protège aussi des cellules contre la sénescence et l'apoptose. Elle participe à un réseau de gènes qui contrôle la stabilité de p53, produit du gène suppresseur de tumeurs qui lui-même contrôle la réponse des cellules à des agents génotoxiques.

D'ailleurs, les protéines Jun participent à l'expression de la cycline D1 essentielle au cycle cellulaire et fréquemment surexprimée dans des tumeurs. Les facteurs de transcription régulent aussi l'expression de gènes codés par des virus à ADN, comme les virus du papillome ou le virus de l'hépatite B, et sont importants pour leur propagation et l'évolution d'infections virales vers des tumeurs.

Empreinte chromosomique et inactivation du chromosome X

Certains cherchent à déchiffrer les mécanismes moléculaires responsables d'un phénomène d'empreinte chromosomique qui contrôle les divisions asymétriques chez la levure Schizosaccharomyces pombe. Ce processus permet à la levure de changer de types sexuels, assurant une proportion équivalente des deux sexes au sein d'une colonie. Des études antérieures ont montré que ce processus est initié par une lésion simple brin au locus sexuel et implique la réplication de l'ADN. La lésion simple brin remplit tous les critères d'une cassure site spécifique : elle apparaît sur un seul des deux chromatides filles, lors de la réplication brin discontinu, est maintenu au cours du cycle cellulaire et devient actif à la réplication suivante. D'autre part, il a été montré que cette coupure, bien que site-et-brin spécifiques, est indépendante de la séquence. Cependant, les mécanismes responsables de la formation et du maintien de cette lésion simple chaîne sont encore inconnus.

Par ailleurs, l'étude de l'inactivation du chromosome X a été poursuivie. La séquence complète de la région Xic (Centre d'inactivation du chromosome X) chez la souris ainsi que celle, partielle, des bovins ont pu être obtenues. L'annotation comparative de ces séquences et de celles de l'homme devrait permettre de mieux cibler les éléments régulateurs de Xist qui font l'objet d'études mutationnelles visant à remplacer successivement les éléments préalablement enlevés. Des résultats significatifs ont aussi été obtenus concernant le transcrit Tsix, censé contrôler l'expression de Xist (X-inactive specific transcript) dans l'embryon précoce. Ainsi, il a été démontré que l'empreinte parentale sur ce locus est assurée par un autre mécanisme que la méthylation.

Métabolisme des ARN

Différentes approches sont utilisées pour identifier de nouveaux facteurs impliqués dans le métabolisme des ARN dans la levure S. cerevisiæ. Une importante base de données centrée sur le métabolisme des ARN (maturation, transport et dégradation) a été construite. De nouvelles protéines ont été identifiées et reliées à des voies métaboliques. On a en particulier pu montrer que les protéines Lsm étaient reliées physiquement à la fois à des facteurs d'épissage et à des facteurs cytoplasmiques impliqués dans la dégradation des ARN messagers.

Ceci suggère un rôle pour le complexe Lsm dans deux voies métaboliques distinctes, ce qui a été confirmé par des analyses fonctionnelles. De même, un lien physique entre des constituants du nucléoplasme et le pore nucléaire a été mis en évidence.

Une méthode biochimique de purification par affinité est utilisée afin de valider et d'étendre les réseaux d'interactions doublehybride. L'identification des constituants des différents complexes est réalisée par spectrométrie de masse. Vingt-quatre protéines ont ainsi été analysées en quelques mois, permettant l'identification de six nouveaux complexes biochimiques à partir desquels 34 protéines ont été identifiées. L'analyse fonctionnelle de ces différents complexes est en cours. Par exemple, on a pu caractériser 12 nouvelles protéines de la petite sous-unité ribosomale des mitochondries. De même, on caractérise actuellement un nouveau complexe impliqué dans la maturation des ARN ribosomaux 5,8S et 25S.

Parallèlement à ces approches, on met au point des cribles génétiques afin d'identifier des liens fonctionnels comme, par exemple, entre la dégradation des ARNm et la régulation du cycle cellulaire.

Génétique et Biologie du développement

Les recherches sur le développement portent surtout sur la formation des muscles et du cœur et sur la différenciation des neurones chez la souris, dans le but de comprendre comment les cellules qui vont contribuer au tissu différencié sont spécifiées et quels sont les facteurs génétiques qui contrôlent en cascade l'activité de familles de gènes de différenciation.

Muscle et cœur

En ce qui concerne la formation des muscles, l'intérêt se porte sur les facteurs moléculaires de la détermination myogénique. Le locus génétique dit Mrf4-Myf5 contient des éléments qui agissent à distance, et dont l'un est maintenant découpé en sous-éléments chacun correspondant à une spécification différente dans l'espace des masses musculaires. Parmi les signaux de la myogenèse, la voie Notch intervient dans la formation de certaines masses musculaires et les gènes Six ont un rôle probable de régulation. Dans le but de remonter la filière de facteurs qui contrôlent la myogenèse, la régulation complexe du gène qui code le facteur de détermination musculaire Myf5 est étudiée. Le facteur de transcription Pax3 qui se trouve également en amont de la hiérarchie génétique qui régule la myogenèse est également étudié et un facteur de transcription à doigts de zinc et une kinase ont été isolés. L'analyse du gène de l'actine cardiaque a permis l'identification de plusieurs séquences activatrices dont une est spécifique du myocarde et à un moindre degré du muscle squelettique.

La cardiogenèse est étudiée avec des souris dites “cardiosensors” qui expriment un transgène dans des domaines particuliers du cœur ou du mésoderme précardiaque. Cette approche a permis de mettre en évidence pour la première fois chez la souris la contribution d'une région du mésenchyme antérieur à la formation du cœur.

Le clonage du site d'intégration du transgène près du gène d'un facteur de croissance, exprimé dans les cellules précurseurs cardiaques, suggère que ce facteur, le FGF, est impliqué dans leur recrutement dans le tube cardiaque en formation.

Une autre approche expérimentale, par analyse clonale rétrospective donne des aperçus nouveaux sur les populations cellulaires qui contribuent au myocarde et donc sur la formation des différentes régions du cœur.

Système nerveux

Du côté du système nerveux, le contrôle génétique de la mise en place des régions céphaliques est étudié sur une lignée de souris mutantes pour l'homéogène Otx2. Les segments devant former le pro-encéphale et le mésencéphale sont éliminés par la mutation. Le transcriptome des embryons sauvages au tout début de la gastrulation a été comparé à celui des embryons Otx2-/-. Parmi plus de deux cents gènes activés, réprimés ou fortement modulés par Otx2 à ce stade embryonnaire, ceux responsables de l'induction du neuroectoderme antérieur sont recherchés. Deux facteurs sécrétés, FGF-15 et Dkk-1, sont transcrits respectivement dans l'ectoderme embryonnaire et dans l'endoderme viscéral.

Enfin, le rôle important dans la neurulation du gène Nap1l2, lié au chromosome X, a été examiné en détail. Ce gène semble contrôler la prolifération des cellules neuronales par de multiples interactions avec des molécules telles que les cyclines. En l'absence de ce gène, les cellules neuronales précurseurs se mettent à proliférer (ou prolifèrent plus rapidement) suggérant un rôle éventuel de ce gène dans la tumorigenèse.

Choix ectoderme-mésoderme

Les gènes Msx1 et Msx2 qui codent pour des facteurs de transcription à homéodomaine, sont exprimés essentiellement dans des régions d'induction entre ectoderme et mésoderme. Les mutants de Msx1 présentent à la naissance des défauts cranio-faciaux qui attestent d'une fonction de ce gène dans l'induction à ces sites. Un phénotype inattendu a été révélé cette année chez le mutant. Il consiste dans un défaut de formation de la commissure postérieure du diencéphale et l'absence corrélative de l'organe subcommissural, qui a pour conséquence une hydrocéphalie à la naissance. L'architecture de la ligne médiane dans cette région est altérée.

Les profils d'expression de Msx1 et Msx2 sont très semblables, et les activités des deux gènes probablement redondantes en de nombreux sites. De plus, le gène Msx1 étant impliqué dans la voie de signalisation de BMP4, notamment dans le mésenchyme dentaire, un programme d'inactivation conditionnelle de ce dernier facteur a été initié, tandis que l'étude des interactions entre la protéine MSX1 et le promoteur de BMP4 était engagée.

Les souris invalidées pour le gène de la vimentine et de la desmine ont été analysées de façon détaillée, ce qui a permis de mettre en évidence des fonctions biologiques jouées par ces protéines. D'autre part, les gènes des kératines K6a et K6b ont été invalidés, ce qui a permis de démontrer leur rôle structural essentiel dans la formation de la muqueuse orale.

Lignages cellulaires

Une méthode d'analyse mise au point ces dernières années permet de dévoiler les stratégies cellulaires à l'œuvre dans la mise en place dans l'embryon du plan de formation du système nerveux central (SNC) et du système musculaire.

Après une phase initiale de dispersion des cellules au tout début du développement, une séparation clonale entre les futures parties antérieure et postérieure du SNC est observée. Les comportements des cellules dans ces deux territoires sont ensuite radicalement différents. La partie antérieure se construit par subdivision progressive du territoire alors que la partie postérieure se construit par production successive des éléments à partir d'un pool particulier de cellules. L'étape suivante consiste en une restriction de la dispersion des précurseurs selon l'axe longitudinal. Cette restriction topologique précède, mais peut-être aussi concourt à l'apparition des neuromères, unités fondamentales du développement du SNC.

La même méthode, adaptée au système musculaire, a permis de mettre en évidence un second système de cellules-souches à l'origine des précurseurs des segments myotomaux. De nouveau, ce système construit les structures suivant un mode temporel. Les pools de cellulessouches à l'origine du SNC et du système musculaire occupent des territoires distincts dans la région du nœud et du sillon primitif de la gastrula. Cette unité dans la formation des éléments du tronc et la différence radicale d'avec les parties plus antérieures pourrait constituer des invariants majeurs du plan de formation de tous les vertébrés.

Le rôle dans l'établissement du phénotype hépatique de différents facteurs de transcription spécifiques du foie a été défini. Les efforts ont été concentrés sur l'étude de HNF4a, facteur clef pour la différenciation hépatique. Une séquence d'ADN stimulatrice du gène HNFa , a été analysée. De plus, le gène HNF4a possède deux promoteurs dont l'usage varie au cours du développement du foie. La protéine issue de l'expression précoce à partir du promoteur distal, montre une transactivation particulièrement forte de gènes exprimés tôt au cours du développement. En revanche, la molécule produite à la naissance à partir du promoteur proximal, transactive surtout les gènes exprimés tard.

Des cellules de foie dérivées de souris transgéniques portant une forme constitutivement active du récepteur du facteur de croissance hépatique (HGF/SF) ont été immortalisées. Elles sont composées de cellules épithéliales-hépatocytaires et de cellules de forme fibroblastique baptisées “palmates”. Ces dernières sont bi-potentes et peuvent se différencier en hépatocytes ou cellules biliaires. Le FGF a été identifié comme le facteur qui induit la différenciation vers l'hépatocyte et le TGFb comme celui qui stabilise le phénotype palmate. Enfin, après avoir démontré le rôle essentiel du facteur de transcription vHNF1 dans la différentiation de l'endoderme viscéral, une analyse de la fonction de cette protéine par mutagenèse conditionnelle a été entreprise.

Mutants naturels du développement

L'étude de mutants naturels de la souris est poursuivie. Une analyse moléculaire et génétique de polydactylies murines est en cours. Ces mutants présentent une duplication antérieure dans le bourgeon de membre de la zone d'activité polarisante, normalement postérieure. La caractérisation des gènes correspondant à ces mutations devrait contribuer à la compréhension des mécanismes qui positionnent la zone polarisante. Dans cette perspective, l'isolement du gène muté chez la souris polydactyle a été entrepris. Le déterminisme du phénotype est complexe avec un locus majeur sur le chromosome 12 et deux gènes indépendants sur le chromosome 4. Le gène responsable de la mutation de digitation anormale dan code pour un récepteur des lipoprotéines.

Une mutation neurologique chez la souris, appelée “progressive motor neuronopathy” et qui semble affecter seulement les nerfs moteurs, est également étudiée. Le gène responsable a été localisé dans un fragment de 850kb du chromosome 13 murin. La mutation létale conditionnelle, Om, entraîne la mort de l'embryon au stade morula-blastocyste. Une carte physique complète de la région génétique contenant le locus Om, a été établie et trois gènes candidats sont actuellement en mise à l'épreuve fonctionnelle.

Génomes

Les progrès technologiques permettent de déterminer en quelques mois le génome de nombreuses espèces, bactériennes en particulier. Il est probable qu'une large part de la biologie reposera dans le futur sur l'exploitation des séquences génomiques.

Génomes bactériens

La détermination des séquences bactériennes se poursuit.

Les spirochètes, bactéries à croissance lente dont la génétique est peu développée, sont désormais étudiés. La séquence du génome de Leptospira interrogans est pratiquement terminée à Shanghai et une collaboration est en cours pour l'annotation de ce génome. L'étroite proximité génétique de Yersinia pestis avec un pathogène de virulence bien moindre, Y. pseudotuberculosis sera utilisée dans une approche de génomique comparative. Pour cela, le séquençage du génome de Y. pseudotuberculosis a été entrepris.

Afin de mieux comprendre la biologie et le pouvoir pathogène des mycobactéries responsables de la lèpre et de la tuberculose, l'analyse systématique de leur génome a été entreprise. Les séquences du génome de Mycobacterium tuberculosis et de celui de M. leprae étant achevées, un programme de génomique fonctionnelle et comparative a été initié. À l'aide de biopuces, la présence au sein du complexe du bacille tuberculeux d'un certain nombre de régions chromosomiques variables, dont quelques-unes ont vraisemblablement contribué à l'atténuation de la souche vaccinale, M. bovis BCG Pasteur, a été mise en évidence. Leur rapport avec la virulence et les différences phénotypiques fait actuellement l'objet d'une analyse de génomique fonctionnelle. Les génomes de Listeria monocytogenes, responsable d'infections très graves d'origine alimentaire, et de L. innocua, une espèce non pathogène très proche, ont été annotés dans le cadre d'un projet européen.

Deux séquences génomiques de Helicobacter pylori sont disponibles qui permettront une analyse comparative de souches cliniques fondées sur l'étude de la distribution des gènes et l'amorce d'une analyse fonctionnelle du génome.

Par ailleurs, le séquençage et l'annotation complète du plasmide de virulence de Shigella flexneri ont été réalisés. Les résultats ont permis d'identifier, en sus de l'îlot de pathogénicité codant pour le secréton de type III et l'opéron codant pour les effecteurs sécrétés à l'entrée de la bactérie dans les cellules épithéliales et lors de la mort apoptotique des macrophages, une quinzaine de gènes codant pour des protéines dont il convient d'identifier la fonction. La quasi totalité du génome d'une autre entérobactérie, Photorhabdus luminescens, a aussi été déterminée. Cette bactérie commensale d'un nématode parasite d'insecte est un modèle pour l'étude des interactions hôte-parasite mais est aussi capable de produire de nombreux insecticides, bactéricides et fongicides.

Enfin, le séquençage du génome de Streptococcus agalactiae (groupe B), responsable d'infections néonatales qui sont un problème important de santé publique, est en cours.

Identification de gènes clefs de la vie bactérienne

L'étude comparative de deux couples de génomes, chacun constitué du génome d'une bactérie de référence et d'une bactérie modèle de maladie, permet de définir les enzymes clefs de la vie microbienne. Deux microorganismes de référence sont utilisés : Escherichia coli, le plus ancien modèle des généticiens et Bacillus subtilis, bactérie source de nombreuses enzymes industriels. Ces bactéries sont comparées respectivement à Photorhabdus luminescens, qui tue les insectes, et Bacillus cereus, bactérie sporulante impliquée dans de nombreuses maladies et dont l'un des proches est l'agent du charbon.

L'étude porte sur l'identification et la fonction de gènes pivots de l'adaptation globale de la bactérie à son environnement. L'accent est mis en particulier sur le métabolisme des molécules contenant du soufre. L'analyse de l'ensemble des produits de la transcription, associée à celle de toutes les protéines de la bactérie, a mis au jour de grands ensembles régulés de la même manière. En raison de la masse très importante de données engendrées par le séquençage des génomes et de la nature énigmatique de beaucoup de gènes découverts à cette occasion, ces études sont complétées par un ensemble de recherches bioinformatiques. Par ailleurs une plate-forme d'annotation génomique, Imagene, a servi à établir un modèle général d'identification des erreurs dans les séquences génomiques.

Génomes bactériens, taxonomie et diagnostic

La facilité avec laquelle on dispose de séquences homologues dans des microorganismes différents a bouleversé la taxonomie bactérienne. La détermination des séquences du gène codant l'ARN ribosomique16S permet d'asseoir la taxonomie bactérienne sur des bases phylogénétiques solides et de mettre au point des sondes spécifiques d'espèces. L'hybridation in situ en fluorescence permet la détection, l'identification et le dénombrement des bactéries en deux heures. Des outils de typage moléculaire sont développés dans un but épidémiologique pour la surveillance des colibacilles et des shigelles. C'est la première fois qu'un système moléculaire remplace un système complexe de sérotypage avec quasiment les mêmes résultats. Cette approche a permis de découvrir un nouveau sérotype de Shigella. Un travail analogue a été entrepris pour les antigènes flagellaires de Salmonella.

Chez Borrelia, toutes les souches isolées de formes chroniques de la maladie de Lyme appartiennent à seulement 10 clones sur la soixantaine que compte un arbre phylogénétique dressé avec les 150 séquences disponibles d'un gène codant une protéine de membrane. Le génotypage de ce gène a des implications en thérapeutique et en prévention. Il en est de même avec l'identification précise de l'espèce des bactéries à Gram positif basée sur le séquençage du gène sodA.

Le laboratoire des Listeria participe à un projet de construction de puces à ADN, pour réaliser un typage très précis de chaque souche de Listeria monocytogenes, et d'analyser ses caractères épidémiogènes et de pathogénicité. En fait, de nombreuses unités et centres nationaux de référence ont des activités taxonomiques dans le but de créer ou d'améliorer les outils d'identification et de typage des bactéries ou des champignons

Le génome d'Anopheles gambiae

Un nouveau programme de grande envergure concerne le génome du moustique Anopheles gambiae, vecteur du paludisme. Les banques de séquences contiennent environ 24 000 séquences répertoriées, dont 17 500 sont issues d'une même banque, et que nous avons annotées. Après la drosophile, A. gambiæ sera ainsi le deuxième insecte dont le génome est séquencé et l'objectif est de réaliser une comparaison des génomes de ces deux espèces, surtout après que l'on ait trouvé de grandes ressemblances avec une région du génome de la drosophile. Des résultats préliminaires montrent qu'à l'intérieur de zones très semblables entre les deux espèces, il existe des paires de gènes orthologues très proches sur chacun des deux génomes, révélant une synténie entre gènes voisins. Ainsi, même si de fréquents réarrangements de séquences ont dû exister au cours de l'évolution divergente de ces deux diptères (100 millions d'années), certains gènes semblent échapper à cette dérive, pour une raison mal comprise mais qui a peut être trait à une pression de sélection commune.

Susceptibilité génétique aux maladies

Le contrôle génétique de la susceptibilité au diabète de type 1 chez la souris est analysé grâce à la construction de nouvelles lignées de souris congéniques. La définition des loci Idd6, Idd19 et Idd20 sur le chromosome 6 est en cours. Les efforts sont actuellement focalisés sur deux de ces loci situés dans les régions les mieux définies afin de “pêcher“ les gènes correspondants.

La recherche de gènes de prédisposition au diabète humain se poursuit et deux régions de susceptibilité au diabète insulino-dépendant sont étudiées par l'étude combinée de familles d'origine française, américaine et scandinave. L'identification de gènes candidats est en cours. Le gène impliqué dans le syndrome de Wolcott-Rallison (un syndrome autosomal récessif associant un diabète néonatal insulino-dépendant irréversible et une pathologie osseuse) et son implication dans le diabète auto-immun a été identifié avec le facteur EIF2AK3 (“translation initiation factor 2-a kinase 3”).

D'autres modèles de pathologies humaines sont étudiés. Le gène de la transferrine (Tf), protéine responsable du transport du fer dans l'organisme est étudié sur des lignées de souris transgéniques. La surexpression de la Tf dans le cerveau de ces animaux est accompagnée d'une expression augmentée des marqueurs de la myéline et d'une matière blanche surdéveloppée. En outre, les axones semblent sains et plus larges. Ces animaux ont un comportement normal et une meilleure coordination motrice que les souris non transgéniques. Dans le cas de la mélanotransferrine, une protéine fortement exprimée dans les mélanomes et marqueur précoce de la maladie d'Alzheimer, c'est l'association de protéines qui contrôlent l'expression spécifique du gène qui est analysée et plus particulièrement les protéines de liaison à de l'ARN double brin. Enfin, un groupe de gènes codant trois apolipoprotéines, A-I, C-III et A-IV, impliquées dans le transport des triglycérides et du cholestérol et dans le métabolisme des lipides et par voie de conséquence dans l'athérosclérose, est étudié dans des animaux génétiquement modifiés. Il a été observé que la surexpression de ces gènes induit une hyperlipidémie mais réduit l'athérogenèse. Ces souris sont ainsi très utiles pour le criblage de nouvelles molécules anti-athérogéniques.

L'infection persistante par le virus de Theiler de souris sensibles s'accompagne d'une inflammation chronique et de lésions démyélinisantes qui miment celles de la sclérose en plaques. L'identification des gènes de résistance dans cette maladie modèle peut permettre d'identifier des gènes candidats chez l'homme.

En sus du gène d'histocompatibilité H-2Db, des gènes localisés sur le chromosome 10 de part et d'autre du gène codant pour l'interféron g contribuent à la résistance ; un autre sur le chromosome 14 affecte l'étendue de la démyélinisation. Un autre sur le chromosome 11 contrôle l'intensité de la maladie chez les animaux ayant une charge virale élevée.

Chez l'homme, l'étude du déterminisme de la différentiation sexuelle a permis la mise en évidence de deux gènes autosomiques responsables respectivement de dygénésie testiculaire et d'hypospadias. La recherche de microdélétions du chromosome Y sur une grande population européenne d'hommes infertiles n'a pas révélé d'haplotype à risque mais a permis de découvrir un haplotype du chromosome Y qui prédispose à la pathologie des hommes 46, XX, et aussi un haplotype du chromosome Y associé à une spermatogénèse réduite. Les épidémiologistes cherchent à identifier les gènes qui interviennent dans la variabilité des réponses dans l'infection palustre. Cette étude est menée dans les villages sénégalais de Dielmo et Ndiop, en zone d'endémie palustre, qui font l'objet de nombreuses recherches épidémiologiques, cliniques, et immunologiques depuis environ 10 ans (Instituts Pasteur de Dakar et de Paris). Des ADN et des phénotypes palustres de 900 personnes ont été collectés, et des arbres généalogiques de la population établis. Le criblage des génomes, complété par l'étude de gènes candidats, a débuté.

En collaboration avec plusieurs laboratoires extérieurs, il a été montré qu'une maladie humaine, Incontinentia pigmenti, était due à une mutation du gène NEMO, qui code le composant central d'un complexe de protéines kinases essentiel à la transmission des signaux. Un modèle animal de cette pathologie et de ses signes cliniques a été obtenu par inactivation partielle ou totale du gène NEMO chez la souris.

Immunologie et immunopathologie

Etude de la physiologie du système immunitaire et étude de l'implication des composants du système immunitaire en pathologie, immunologie et immunopathologie sont inséparables.

Mise en place du système immunitaire

Les cellules du système immunitaire dérivent toutes des cellules souches hématopoïétiques. L'étude de leur potentiel de régénération est importante autant en immunologie fondamentale qu'en thérapie cellulaire. L'étude quantitative des précurseurs hématopoïétiques qui migrent vers le thymus au cours de la vie fœtale a montré qu'entre les 12ème et 14ème jours de gestation, la colonisation thymique est très forte. D'autre part, si la régénération thymique dépend du nombre de cellules souches injectées, la repopulation des organes lymphoïdes secondaires ne l'est pas, ce qui implique nécessairement la prolifération des lymphocytes à la périphérie. Les lymphocytes T de l'épithélium intestinal sont de loin les plus nombreux mais paradoxalement, leur fonction et origine sont mal définies : ceux qui expriment la molécule CD8 proviennent de précurseurs CD4- et CD8- thymiques qui prolifèrent localement, puis migrent dans la muqueuse intestinale.

Cellules régulatrices et autoimmunité

La recherche de lymphocytes T régulateurs des réponses immunes et de la tolérance, est un terrain de recherches intenses. Une population exprimant le récepteur T gd, capable de produire de l'Interleukine 4, a été caractérisée et deux loci génétiques qui influencent son développement ont été identifiés. Une autre population minoritaire de lymphocytes T CD4, incluant des cellules mémoire, contrôle la taille du compartiment des lymphocytes T naïfs par le biais d'une production d'IL-10. En revanche, la contre-sélection des lymphocytes autoréactifs n'a été que très peu étudiée : l'établissement de la tolérance des lymphocytes T aux chaînes légères • des anticorps dépend de cellules T CD4+ qui régulent négativement les cellules T cytotoxiques spécifiques de kappa. Un modèle de grand intérêt pour la compréhension de la tolérance est celui dit de la “suppression allotypique“ dont le mécanisme a été élucidé. Ce modèle permet aussi de mieux comprendre l'interaction séquentielle entre lymphocytes T CD4, CD8 et cellules dendritiques (CD). La clé de ce modèle est l'interaction des lymphocytes CD4 activés avec la CD via le couple récepteur CD40-ligand qui permet à la CD d'induire la maturation des CD8 en effecteurs cytotoxiques spécifiques du même antigène. Ce système expérimental a permis de démontrer pour la première fois que le récepteur CD40 pouvait avoir un rôle de contrôle négatif. La technologie des tétramères de molécules d'histocompatibilité a récemment permis de montrer qu'une large fraction de lymphocytes T autoréactifs échappent à la sélection négative dans le thymus. Des mécanismes d'homéostasie et/ou de délétion périphérique doivent donc exister pour contrer l'émergence de maladies auto-immunes. Les cellules NKT suivent des règles de sélection très particulières. La sélection de leur récepteur dans le thymus s'opère sur une molécule de classe I, tandis que leur action à la périphérie est au moins pour partie indépendante de cette molécule. Sur le versant de l'immunité humorale la sélection des lymphocytes B pendant leur développement dépend de la quantité d'auto-antigène : des quantités très faibles d'auto-antigène induisent la sélection positive mais aussi l'activation des lymphocytes B auto-réactifs. Réseau international Recherche Enseignement Santé

Cytokines

Outre les contacts entre cellules, les cellules du système immunitaire échangent des messagers moléculaires, les cytokines. Les réponses issues des interactions entre les cytokines et leurs récepteurs membranaires sur la cellule cible incluent des modifications de leur survie, prolifération et fonction effectrice. Les récepteurs de l'IL-2 et les récepteurs pour l'antigène des lymphocytes T sont particulièrement étudiés. Lorsque les lymphocytes T sont stimulés par des cellules présentatrices d'antigène, une synapse immune se met en place. Le rôle du cytosquelette dans ce processus a été démontré. La liaison de l'IL-2 à son récepteur est rapidement suivie de l'internalisation du complexe dont une nouvelle voie a été décrite. Les cytokines jouent un rôle décisif dans la différentiation des cellules souches. in vivo, les points de contrôle où interviennent les cytokines sont encore mal définis. Un groupe a étudié les rôles des cytokines •cdépendantes (la chaîne commune à la transmission du signal des récepteurs pour les IL -2, -4, -7, -9 et –15) et de leurs récepteurs dans la lymphopoïèse, l'homéostasie lymphoïde périphérique, et les réponses immunes. On a pu démontrer pour la première fois que la survie des lymphocytes T naïfs exige des cytokines gc- dépendantes au contraire des cellules mémoire. Toutefois, et de manière inattendue, les cellules naïves et mémoire prolifèrent in vivo en présence de l'antigène et en absence de ces cytokines. Les cytokines gcdépendantes sont elles vraiment des facteurs de croissance essentiels des lymphocytes T ? En tout cas, ce concept semble validé par la correction de l'immunodéficience induite par le virus du SIDA. En effet, chez les patients sous tri-thérapie et chez qui on n'observe pas de remontée des lymphocytes T CD4, l'immunothérapie par l'IL-2 permet de corriger ce défaut sans augmentation de la charge virale.

Enfin, pour repérer précisément les programmes de différenciation des lymphocytes T auxiliaires, une stratégie originale d'identification des gènes impliqués dans le passage des lymphocytes T de l'état naïf à l'état Th1, Th2 et mémoire, a été mise au point. Cette stratégie indépendante des présupposés des puces à ADN a été appliquée avec succès à l'identification des gènes transcrits de manière sélective dans les cellules Th1 ou Th2.

Mécanismes de signalisation intracellulaire

La compréhension de la signalisation intracellulaire, de l'ensemble des mécanismes moléculaires qui décodent l'information reçue sur des récepteurs membranaires, est essentielle. Ces signaux induisent des changements rapides qui incluent le recrutement et l'organisation d'un nombre considérable de composants de signalisation intracellulaire. La cellule intègre ces signaux dont le résultat est la nature même de la réponse à l'antigène.

Des études menées à l'aide de souris “knock-in“ pour ZAP-70, la protéine tyrosine kinase essentielle à l'activation de lymphocytes T, ont permis de mieux comprendre son contrôle et sa fonction. Des souris transgéniques “gain-de-fonction“ de ZAP-70 dans les lymphocytes CD8 matures, permettent d'étudier les perturbations apportées à l'état de tolérance et montrent l'existence de mécanismes de compensation dans l'appareil de signalisation. Dans la costimulation via CD28, contrairement à une notion répandue, le rôle de CD28 est celui d'amplificateur direct de la signalisation du récepteur à l'antigène en augmentant le contact entre le lymphocyte T et la cellule présentatrice d'antigène ainsi que le flux calcique.

La ciclosporine A, un immunosuppresseur employé en transplantation, inhibe chez les lymphocytes T l'activation calcium-dépendante du facteur de transcription NF-AT, mais entraîne aussi un changement drastique de l'expression génique : le dérèglement des transactivateurs nucléaires est responsable de l'expression d'une centaine de protéines nouvelles.

Les mécanismes qui régissent la transmission du signal via le récepteur des interférons (IFN) de type I et l'expression spécifique de certains gènes, sont étudiés. L'expression dans la même cellule d'un récepteur de cytokine (tel l'IL-12R) qui partage la tyrosine kinase Tyk2 avec le récepteur à l'IFNa/b, entraîne une diminution de la réponse à cette dernière cytokine. Cet effet, dû à une compétition pour l'interaction avec Tyk2, pourrait jouer un rôle dans la polarisation Th1/Th2. Bien que le rôle des IFN a et b dans la polarisation Th1 soit démontré chez l'homme, rien n'est connu sur la sensibilité à ces cytokines pendant la différentiation : une réduction importante de la sensibilité à l'IFNa/b au cours de la différentiation Th1/Th2 a été observée. Une nouvelle protéine qui interagit avec un domaine de Tyk2 et appelée Pot-1 (partner of Tyk2) a été identifiée ainsi qu'un motif qui confère à Tyk2 la propriété de migrer dans le noyau.

Parallèlement, l'étude de souris dont les gènes codant les deux inhibiteurs de NF-kB, IkBa et IkBe ont été inactivés, a permis d'observer un phénotype drastique. Ces souris meurent à la naissance d'un défaut respiratoire. L'apoptose des précurseurs de lymphocytes B ainsi que l'apoptose des thymocytes doubles positifs sont également observés. L'absence simultanée de IkBa et IkBe affecte donc très tôt les précurseurs des lymphocytes.

L'immunité innée aux bactéries repose, entre autre, sur les réponses de différentes composantes cellulaires de l'organisme, y inclus les granulocytes, aux lipopolysaccharides (LPS). Ainsi, on a pu montrer que la réponse à des LPS non classiques (par exemple issues de Rhizobium) était indépendante du récepteur Toll-like 4 au contraire des autres LPS. La sensibilité au LPS est abolie chez les souris déficientes en cellules NKT et restaurée par un transfert adoptif de cellules NKT normales en l'absence d'expression de CD1. Ces résultats suggèrent que les lymphocytes NKT sont des composants de l'immunité innée.

Mécanismes de diversification des récepteurs à l'antigène

La diversité des récepteurs pour l'antigène des lymphocytes B et T est la base de l'immunité adaptative et l'étude de leur origine est activement menée. La présence de régions de diversité N dans les récepteurs, dont l'enzyme Terminale Transférase (TdT) est responsable, a été établie pour la première fois dans la chaîne alpha du TCR de la souris à la naissance. Deux isoformes de l'enzyme ont été découvertes et leurs propriétés enzymatiques comparées. L'analyse de la structure tridimensionnelle de la TdT se poursuit, tandis qu'une autre étude révèle que le réarrangement génétique aux loci des Ig est précédé du positionnement des nucléosomes et de l'acétylation des histones H4.

La détermination de la diversité des récepteurs à l'antigène s'est poursuivie avec l'étude de souris auxquelles manquent certains antigènes d'histocompatibilité ou encore la TdT, et enfin chez des souris ne présentant qu'un seul peptide antigénique. La diversité du récepteur T est notable dans tous les cas de figure et simplement 10 fois plus faible dans les souris TdT “knock out”. Le répertoire des cellules NKT, montre également une extrême diversité et un caractère polyclonal en dépit de leur phénotype activé/mémoire. Réseau international Recherche Enseignement Sa

Dans la même optique, une souris “monoclonale“ qui possède un répertoire d'anticorps limité au gène réarrangé VHT15 pour la chaîne lourde et à seulement deux gènes l pour la chaîne légère est étudiée pour comprendre les mécanismes de diversification chez l'individu naïf ou immunisé contre des haptènes définis.

Une autre étude a permis de mesurer chez la souris la proportion de lymphocytes B qui ne subissent pas d'exclusion allélique et l'étude de souris dotées de trois chromosomes 12 a permis d'en comprendre le mécanisme. Enfin, un nouveau logiciel d'étude de la diversité, ISEApeaks® a été développé.

Nouvelles stratégies vaccinales et essais anti-tumeurs

De nouvelles stratégies vaccinales, basées sur nos connaissances en immunologie fondamentale et sur l'exploitation des avancées de l'ingéniérie génétique, sont mises au point. L'une est fondée sur la toxine adénylcyclase de l'agent de la coqueluche. Des formes détoxifiées de la toxine montrent un fort potentiel vaccinal dans plusieurs réponses antivirale ou antitumorale. La toxine se fixe sur l'intégrine CD11b des cellules dendritiques, une étape indispensable pour leur activité biologique et la réponse immunitaire.

L'étude d'un antigène glycosidique Tn, associé aux cancers du sein, du côlon ou de la peau, a permis la mise au point d'un vaccin totalement synthétique antitumeur formé par un trimère de l'épitope Tn associé à un épitope T. Cette molécule s'est montrée très efficace pour induire un rejet de cellules cancéreuses chez des souris. D'autre part, la mise au point d'un système de mélanome inductible chez la souris permet l'étude de la réponse immunitaire pendant les étapes successives de la progression cancéreuse. Un protocole de suivi des réponses cytotoxiques spécifiques d'antigènes de tumeurs et des cellules mémoire chez les sujets en traitement par immunothérapie spécifique a été mis en place.

Inflammation et allergie

Le rôle des cellules inflammatoires, leur recrutement et activation associés aux perturbations fonctionnelles, sont étudiés particulièrement dans le syndrome d'hyperréactivité bronchopulmonaire. Notamment, l'injection d'endotoxine par voie nasale, induit une broncho-constriction dépendante des neutrophiles et indépendante du TNF et résistante aux corticoïdes. Ces mécanismes seraient aussi impliqués dans le syndrome de détresse respiratoire de l'adulte (SDRA). Le rôle des macrophages alvéolaires, des polynucléaires neutrophiles et de différentes cytokines dans l'induction de ces syndromes cliniques sont activement examinés.

Les mécanismes de sécrétion et le rôle joué par la phospholipase A2 sécrétée et la prostaglandine H2 synthétase, deux enzymes dont la synthèse augmente lors de l'inflammation, sont à l'étude. Ces enzymes sont exprimées par les cellules endothéliales de la microcirculation pulmonaire humaine et par les macrophages alvéolaires. La phopsholipase A2 sécrétée joue un rôle majeur dans la destruction du surfactant pulmonaire.

Notre Institut dispose de la consultation d'allergologie la plus importante de l'Île-de-France, et réalise plus de 10 000 consultations par an. La recherche clinique en allergologie est axée sur la tolérance orale aux allergènes et l'étude des autoanticorps dirigés contre le récepteur de haute affinité pour l'IgE. La recherche fondamentale est consacrée à l'étude des relations entre le mastocyte, les cellules dendritiques et les cellules T, ainsi qu'au rôle immunorégulateur du mastocyte et aux mécanismes moléculaires de la dégranulation de cette cellule.

Pathologies des cellules du système immunitaire

La maladie des agglutines froides est caractérisée par la production d'auto-anticorps anti-globule rouge, qui reconnaissent des déterminants glycolipidiques et induisent une anémie hémolytique autoimmune. Un modèle transgénique murin de cette maladie a été construit, en transfectant les gènes d'un anticorps humain. Ce modèle constitue un modèle murin de la maladie humaine, ainsi qu'un modèle d'étude des mécanismes de tolérance à l'égard des autoantigènes du globule rouge.

La leucémie lymphoïde chronique (LLC) est explorée en collaboration avec le Groupe Français pour l'étude de la LLC. Les objectifs majeurs de cette recherche sont la constitution de la carte d'identité tumorale de cette maladie, en particulier les gènes de prédisposition et les gènes de progression, par la technologie des puces ADN. La définition des conditions optimales pour une vaccination en utilisant des cellules dendritiques sensibilisées par l'idiotype tumoral est à l'étude.

Venins, hémostase et traitements

Les toxines de venin, de par leurs actions très puissantes sur l'hémostase, peuvent aider dans la conception de nouvelles molécules thérapeutiques. Ainsi, un activateur du plasminogène isolé du venin d'un crotale chinois, un inhibiteur de la thrombine du venin de Bothrops jararaca, un activateur plaquettaire très puissant, la convulxine du venin de Crotalus durissus terrificus, et des phospholipases A2 anticoagulantes ont été caractérisés et se sont avérés être de bons candidats pour le développement d'agents antithrombotiques.

Des recherches sont menées pour améliorer le traitement immunologique des envenimations. Un facteur sérique isolé du sérum de crotale protège ce serpent contre sa principale toxine, la crotoxine, et les toxines homologues.

Bactéries et champignons pathogènes

Un des faits remarquables établis ces dernières années est la corrélation entre réponse au stress et pathogénicité du microbe. Les études sur les champignons pathogènes prennent de l'ampleur.

Bactéries

Bordetella

Les bordetelles provoquent des infections respiratoires chez l'homme et l'animal, comme la coqueluche, la rhinite atrophique du porc ou la toux canine. L'année 2000 a été marquée par la découverte d'un récepteur spécifique de la toxine de Bordetella à la surface des leucocytes. En outre, les réponses immunes successives à une infection par B. bronchiseptica, l'évolution des isolats de B. pertussis suite à la vaccination, la diversité d'une adhésine, la pertactine, impliquée dans l'immunité protectrice, la durée de l'immunité induite par un nouveau vaccin coquelucheux acellulaire chez l'enfant, ont été étudiés. Enfin, un modèle murin d'infection respiratoire à B. pertussis a été standardisé.

Borrelia

Transmise par la tique, la borréliose de Lyme représente la maladie à vecteur la plus fréquente avec environ, en France, 10000 cas annuels. Les travaux, menés dans les forêts d'Île-de-France, portent sur l'évaluation de la densité des tiques vectrices, paramètre dominant dans l'incidence de la maladie. La température atmosphérique, celle au niveau du sol et l'importance de la strate herbacée affectent cette densité. Il est ainsi possible, grâce au suivi de la température, de prévoir 4 mois à l'avance la courbe d'activité des tiques, donnée essentielle en matière de prévention.

Vibrio choleræ

Le choléra sévit encore aujourd'hui dans une grande partie du monde et plus particulièrement dans les pays pauvres. L'agent du choléra, Vibrio cholerae, possède deux niches écologiques, la mer et l'homme. L'objectif d'un vaccin cholérique est d'éliminer le vibrion cholérique de cette dernière. La structure d'un antigène de V. cholerae, un polysaccharide, complexé à un anticorps protecteur, a pu être étudiée très finement. L'efficacité protectrice chez la souris d'un vaccin chimiquement défini constitué de cet antigène couplé à une protéine porteuse, l'anatoxine tétanique, ouvre la voie à un vaccin conjugué utilisable chez l'homme.

Des techniques moléculaires sont développées pour l'identification dans l'environnement des espèces de Vibrio pathogènes pour l'homme. Leur implantation dans les eaux littorales françaises étant favorisée par les modifications écologiques du milieu marin induites, notamment, par les activités industrielles, une étude des vibrions de la baie de la Rance est ainsi réalisée. Ces techniques sont aussi utilisées pour caractériser les facteurs de pathogénicité des espèces de Vibrio dans les produits de la mer présentés à l'importation.

Helicobacter pylori

Helicobacter pylori est l'agent étiologique des gastrites chroniques pouvant évoluer vers la maladie ulcéreuse et l'atrophie gastrique, précurseur des adénocarcinomes gastriques. La recherche a pour objectif de mieux comprendre les mécanismes qui permettent à H. pylori de survivre, coloniser et générer des lésions, mais aussi de comprendre le lien avec le métabolisme de la bactérie. Le développement de modèles murins d'infection par H. pylori permet d'étudier le rôle de la réponse inflammatoire dans ces processus. Les enjeux épidémiologiques, cliniques (résistance au métronidazole) et thérapeutiques, ne sont pas ignorés.Le même groupe étudie également le pouvoir pathogène de souches de Escherichia coli associées aux infections urinaires et diarrhéiques et particulièrement les systèmes d'adhésion exprimés par les souches pathogènes. Parmi ceux-ci, le système AFA constitue le premier exemple d'une structure génétique spécifiant à la fois une protéine impliquée dans l'adhésion et une autre impliquée dans l'internalisation de la bactérie. Elle est portée par un îlot de pathogénicité dont l'étude est importante pour la compréhension et le suivi de l'évolution de l'espèce. L'étude des facteurs d'adhésion des E. coli associés à des diarrhées persistantes chez des patients séropositifs pour le VIH a permis de définir un nouveau système d'adhésion.

Leptospires

Les approches de génétique moléculaire étaient inexistantes jusqu'à présent pour le spirochète du genre Leptospira. Un vecteur navette capable de naviguer entre Leptospira biflexa et Escherichia coli a été construit, ce qui permet une approche génétique. Un mutant immobile a ainsi été obtenu par inactivation d'un gène flagellaire. Du côté des réponses des cellules, le lipopolysaccharide de L. interrogans active les macrophages via le récepteur “toll-like“ TLR2 au contraire du LPS des bactéries à Gram- qui utilise la voie TLR4.

Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes, responsable d'infections alimentaires graves, est devenue un système modèle pour comprendre le parasitisme intracellulaire et l'exploitation des fonctions cellulaires par les pathogènes. L. monocytogenes se caractérise par sa capacité à traverser des barrières normalement très étanches : la barrière intestinale, la barrière hémato-encéphalique et la barrière fœtoplacentaire. Dans les tissus qu'elle infecte, tout comme Listeria est en position intracellulaire, elle entre dans de nombreux types cellulaires et s'y multiplie. Après lyse de la vacuole de phagocytose, les bactéries en même temps qu'elles se répliquent dans le cytosol, s'y déplacent et passent de cellule en cellule en utilisant un mécanisme de propulsion très original généré par une polymérisation continue de l'actine cellulaire à l'un des pôles bactériens. Les avancées en pathogénie ont concerné essentiellement plusieurs aspects de l'entrée dans les cellules, en particulier le rôle de ces événements in vivo, l'analyse des vacuoles de phagocytose, l'étude des mouvements intra- et intercellulaires, le contrôle de l'expression des gènes de virulence et l'identification de nouveaux gènes de virulence.

Mycobacterium tuberculosis

Au cours de l'étude de la pathologie tuberculeuse ont été définis de nouveaux mécanismes de virulence (identification des gènes de virulence) de Mycobacterium tuberculosis. Leur recherche systématique est effectuée pour rechercher de nouvelles thérapeutiques et de nouveaux vaccins. Des vaccins recombinants dérivés du BCG sont étudiés. La voie d'administration de ces vaccins, le rôle de la glycosylation dans l'antigénicité des molécules immunodominantes, l'incidence de formes résistantes de la maladie aux antibiotiques classiques et l'investigation de la flore mycobactérienne dans les réseaux de distribution d'eau potable sont étudiés. Les travaux de pathogénie moléculaire sur les Neisseria ont permis de montrer le rôle majeur du nouveau gène de régulation crgA, dans les étapes décisives de l'interaction de N. meningitidis avec les cellules cibles de l'hôte exposé. Ceci ouvre la voie à une meilleure compréhension des mécanismes de déclenchement de l'infection invasive et la mise au point de nouvelles stratégies de prévention et de traitement.

Salmonella

Les recherches sur les salmonelles sont centrées sur les mécanismes de la persistance des salmonelles dans l'environnement et leur entrée dans les cellules épithéliales intestinales, étape cruciale dans le déclenchement d'une salmonellose. La survie bactérienne est partiellement assurée par un facteur sigma RpoS, régulateur clé de la résistance généralisée à différents stress, et qui joue un rôle essentiel dans la régulation des gènes de virulence spv de Salmonella. Les gènes requis pour l'entrée (gènes d'invasion) des Salmonella dans les cellules épithéliales intestinales sont regroupés sur un îlot de pathogénicité. L'expression de ces gènes d'invasion est très finement contrôlée par des régulateurs en cascade, actifs en fonction des conditions environnementales. Deux familles de composés chimiques (acides gras à courte chaîne et acides aromatiques) inhibent in vitro l'expression des gènes d'invasion de Salmonella. Le caprylate de sodium réduit de manière très significative la charge bactérienne dans les souris infectées et protège très efficacement les animaux.

Des cellules intestinales spécialisées dans le transport d'antigènes, les cellules M des plaques de Peyer, sont utilisées comme porte d'entrée par de nombreux agents pathogènes. Les mécanismes d'interaction entre les cellules M et ces agents pathogènes sont à l'étude en vu d'intervention sur la toute première étape de nombreux processus infectieux.

Neisseria

Les travaus de pathogénie moléculaire sur les Neisseria ont permis de montrer le rôle majeur du nouveau gène de régulation crgA, dans les étapes décisives de l'interaction de N. meningitidis avec les cellules cibles de l'hôte exposé.

Ceci ouvre la voie à une meilleure compréhension des mécanismes de déclenchement de l'infection invasive et la mise au point de nouvelles stratégies de prévention et de traitement.

Shigella

Les bases moléculaires, cellulaires et tissulaires de la rupture, de l'invasion et de la destruction inflammatoire de la barrière intestinale par des pathogènes invasifs tels Shigella et Entamœba histolytica, ainsi que les mécanismes inducteurs et effecteurs de la réponse protective anti-Shigella continuent d'être étudiés. Ces données amènent au développement et à l'étude clinique de candidats vaccins contre la dysenterie. Les avancées de l'année concernent les événements de signalisation cellulaire à l'entrée de la bactérie dans la cellule et des progrès importants dans la compréhension des mécanismes induisant l'inflammation intestinale au cours de la shigellose. Une nouvelle famille protéique cytosolique, homologue des protéines de résistance des plantes, est responsable, au sein de la cellule épithéliale, de l'effet du lipopolysaccharide dans les cellules. L'immunogénicité d'antigènes peptidiques mimant les sousunités polyosidiques de la bactérie et constituant un antigène protecteur, a été démontrée. Les essais cliniques de phase I et II du candidat vaccin vivant oral de S. flexneri SC602 ont été poursuivis au Bangladesh.

Staphylocoques

L'un des objectifs de l'étude des staphylocoques est la caractérisation, dans les souches de staphylocoques à coagulase-négative responsables d'infections nosocomiales sur prothèses ostéo-articulaires, des facteurs d'adhésion aux biomatériaux et aux protéines de la matrice extracellulaire. Un gène codant une autolysine liant la fibronectine, ceux impliqués dans la biosynthèse du biofilm ainsi que deux gènes codant des protéines "sérine-aspartate" de la paroi, ont été isolés du chromosome d'une souche infectieuse de Staphylococcus caprae et séquencés. Ces gènes seront mutagénisés pour évaluer leur contribution dans le processus infectieux.

Streptoccocus agalactiæ

Des facteurs de virulence de Streptocccus agalactiae, un agent majeur des infections néonatales sont identifiés. Plusieurs outils génétiques permettant la constrution de mutants ont été mis au point. Un modèle murin qui reproduit la conséquence la plus importante de l'infection invasive néonatale à S. agalactiae, la méningite, a été mis au opint. Le gène d'une superoxyde dismutase à manganèse qui protège S. agalactiae du stress oxydatif, joue un rôle dans la pathogénicité de cette bactérie. Elle est nécessaire au maintien d'une bactériémie élevée en favorisant vraisemblablement l'invasion du cerveau et la persistance des bactéries dans la rate et le foie de souris infectées. L'incorporation de résidus D-Ala dans les acides lipotéchoïques (LTAs) est également importante pour la virulence de S. agalactiae.

Yersinia

Le genre Yersinia comprend trois espèces pathogènes pour l'homme : Y. pseudotuberculosis et Y. enterocolitica, responsables de troubles digestifs, sont largement répandues en France tandis que Y. pestis, l'agent de la peste, sévit à l'état endémo-épidémique en Afrique, Asie et Amérique. Le laboratoire des Yersinia étudie les facteurs responsables de la pathogénicité de Yersinia et les paramètres qui modulent l'expression de ces facteurs. L'intérêt porte plus particulièrement sur le regroupement de certains gènes de pathogénicité en ilôts.

Bacillus anthracis

Bacillus anthracis, bactérie toxinogène extracellulaire, est l'agent du charbon. Dans l'étape initiale de l'infection, les spores de B. anthracis germent dans le macrophage et ce phénomène est associé à la synthèse de toxines. Un opéron de germination plasmidique impliqué dans la virulence, a été identifié. L'étude du mode d'action des toxines œdématogène et létale de B. anthracis est cruciale. En 1998, deux protéines cibles de l'activité protéase du facteur létal avaient été identifiées. Une troisième a été trouvée l'an passé, ce qui représente une piste importante dans l'élucidation des mécanismes du choc toxique induit par cette toxine. Enfin, une protection totale contre le charbon a pu être obtenue chez des animaux immunisés avec un des composants des toxines associé à des spores inactivées. Ceci devrait représenter une amélioration significative du vaccin acellulaire à usage humain qui, actuellement, vise uniquement la protection envers les toxines.

Clostridium

Les neurotoxines botuliques produites par Clostridium botulinum s'associent à des protéines non toxiques pour former des complexes de grande taille. La production des neurotoxines et des protéines associées est contrôlée par un gène, dénommé botR, qui est homologue du gène tetR de C. tetani. Le mode d'action de ces deux gènes est analysé. Le passage de la neurotoxine botulique, sous forme isolée ou de complexe, à travers la barrière intestinale est étudié pour mieux comprendre les facteurs qui contrôlent la toxicité de C. botulinum. Un autre sujet concerne les toxines binaires de Clostridium. Du fait de son association avec des protéines hétérologues, la toxine iota de C. perfringens est le candidat pour internaliser des protéines dans les cellules. La toxine epsilon de C. perfringens, une toxine oedématogène très puissante responsable d'entérotoxémie est également étudiée, à l'aide de couches lipidiques artificielles et d'un modèle cellulaire. Ici encore, l'adaptation aux stress oxydatifs de C. perfringens, agent responsable de maladies pouvant aller de la simple intoxication alimentaire à l'entérite nécrotique ou à la gangrène gazeuse, constitue vraisemblablement un facteur de pathogénicité important pour cette bactérie ubiquitaire. Le pouvoir pathogène de C. difficile, responsable de colites pseudomembraneuses et de la majorité des diarrhées post-antibiothérapiques, repose essentiellement sur sa capacité à produire deux toxines majeures, ToxA et ToxB dont la génétique est en cours d'étude.

Champignons et infections fongiques

Deux levures pathogènes, Cryptococcus neoformans et Candida albicans, responsables d'infections graves chez les patients immunodéprimés, sont étudiées. L'année 2000 a été consacrée à l'étude des gènes de la synthèse de la capsule polysaccharidique de C. neoformans, élément essentiel de sa virulence, de la variabilité génétique de C. neoformans, de la physiopathologie de la cryptococcose, par l'étude de la réponse immunitaire à l'infection par C. neoformans chez l'homme et chez la souris et enfin des facteurs de virulence de Candida albicans. Des puces à ADN ont été préparées qui permettent l'analyse d'une partie du transcriptome chez Candida albicans, levure responsable de la majorité des infections fongiques chez l'homme. Ces puces à ADN ont d'ores et déjà été utilisées pour identifier de nouvelles cibles transcriptionnelles de répresseurs impliqués dans la transition levure-hyphe qui est un déterminant important de la pathogénicité. De nouvelles puces sont en cours d'établissement pour une analyse globale du transcriptome de C. albicans.

Les interactions entre Aspergillus fumigatus et l'homme sont un sujet d'actualité. Aspergillus fumigatus est un champignon filamenteux saprophyte thermophile dont les conidies présentes en permanence dans l'atmosphère et continuellement inhalées par l'homme, peuvent être à l'origine de pathologies respiratoires graves, souvent mortelles chez le patient immunodéprimé. Dans l'aspergillose invasive, sont plus particulièrement étudiés les facteurs de virulence potentiels du champignon et les mécanismes de défense mis en œuvre par le macrophage alvéolaire pour contrecarrer la germination des conidies infectantes. L'organisation structurale de la paroi cellulaire et les enzymes responsables de la biosynthèse des polysaccharides pariétaux sont des clés de la compréhension du développement cellulaire de tous les champignons. Différents outils d'analyse transcriptionnelle et fonctionnelle qui faciliteront l'étude à l'échelle génomique du champignon filamenteux modèle, A. nidulans, et des champignons pathogènes de l'homme, A. fumigatus et Candida albicans, sont mis au point. Chez A. nidulans, ces méthodes sont appliquées à la caractérisation des événements moléculaires et biochimiques intervenant au cours des phases précoces de la germination des spores. Chez A. fumigatus, une recherche systématique de gènes essentiels a été entreprise afin de définir des cibles originales pour le développement de nouvelles molécules antifongiques.

Neurobiologie et neuropathologie

Le système nerveux est l'une des nouvelles frontières de la biologie. L'importance croissante des maladies qui affectent le système nerveux ont transformé son étude en une discipline bien pasteurienne.

Neurobiologie fondamentale

Les recherches sur la formation du tissu nerveux, ont surtout porté sur les protéines membranaires qui assurent les contacts entre cellules, et leur migration dans l'organisme. Ainsi, la chimiokine qui se fixe au récepteur CXC-R4, est-elle exprimée dans le cervelet et l'hippocampe dans des zones de migration et de neurogenèse. Les cellules souches neurales synthétisent une neuréguline membranaire qui stimule leur division et leur survie. Un récepteur soluble des neurégulines transforme ces cellules en oligodendrocytes, les cellules qui synthétisent la myéline. Plusieurs molécules qui couplent entre elles les cellules souches ont été identifiées et l'une d'elles, la connexine 45, est exprimée très tôt dans les oligodendrocytes. Trois nouvelles connexines des synapses électriques de la rétine ont été caractérisées et forment une nouvelle branche de la famille des connexines. Une méthode de cartographie génétique des circuits neuronaux, qui repose sur la construction de protéines couplées à une protéine fluorescente qui migrent à travers les synapses, a permis une visualisation directe des réseaux de neurones.

Les neurones “informent“ les cellules qu'elles innervent par l'intermédiaire de structures particulières, les synapses, où sont libérées des neurotransmetteurs. La biologie et la plasticité de la transmission synaptique, particulièrement inhibitrice, sont étudiées sur des cerveaux de poisson et de rat. Les mécanismes de libération des neurotransmetteurs et leur modification par l'apprentissage sont étudiés. Ces molécules agissent sur des récepteurs- canaux ioniques situés sur la membrane des neurones situés en regard des terminaisons. L'analyse des récepteurs à la glycine, canaux du chlore, vise à élucider la physiologie et la pathologie des synapses inhibitrices. L'activité spontanée des neurones afférents provoque des fluctuations de l'activité neuronale. Des algorithmes basés sur la dynamique non-linéaire ont révélé des variations de cette activité, faite de phases chaotiques renforcées par l'apprentissage et une prédictibilité des décharges neuronales. L'excitabilité des cellules de l'hippocampe, région du cerveau susceptible à l'épilepsie et impliquée dans la mémoire, est contrôlée par des inter-neurones inhibiteurs spécialisés et dont la diversité anatomique et fonctionnelle a été étudiée.

Les travaux sur le récepteur nicotinique de l'acétylcholine, qui intervient au niveau de la jonction neuromusculaire et de synapses nicotiniques centrales, ont été poursuivis avec trois objectifs : l'identification des régions du récepteur engagées dans la reconnaissance de l'acétylcholine, le transport ionique et divers couplages ; l'identification des mécanismes qui contrôlent la distribution des récepteurs ; l'étude des processus intervenant au niveau du système nerveux central, dans le contrôle moteur, l'apprentissage, la dépendance à la nicotine et diverses pathologies cérébrales.

Les éventuelles applications de cette recherche portent sur la pharmacologie du muscle innervé et de récepteurs nicotiniques centraux, sur les phénomènes pathologiques associés à la dénervation du muscle squelettique et à la myasthénie, ainsi que sur les troubles centraux qui résultent d'altérations des, ou qui affectent, les récepteurs nicotiniques : épilepsie, maladie d'Alzheimer ou de Parkinson, vieillissement et dépendance à la nicotine.

L'étude de l'origine de déficits neurosensoriels héréditaires humains est, outre son intérêt médical, une manière d'étudier les organes sensoriels. La recherche de gènes à l'origine de surdité isolée a été facilitée par l'étude de familles consanguines affectées vivant dans des isolats géographiques. Les gènes impliqués dans 8 formes de surdité isolée et 5 formes de surdité associée à d'autres symptômes ont été identifiés. Ceux responsables d'une nouvelle forme de surdité isolée et du syndrome de Usher 1C (surdité profonde et rétinopathie pigmentaire évoluant vers la cécité) ont été découverts cette année. Des avancées significatives ont été réalisées dans la compréhension du syndrome de Usher 1B, d'une autre forme de surdité isolée et dans celle du syndrome de Kallmann de Morsier (qui associe à la surdité un déficit de l'odorat et l'absence de puberté). Fait inattendu, malgré l'hétérogénéité des déficits auditifs isolés congénitaux, la moitié des atteintes implique le gène de la connexine 26. De surcroît, une mutation particulière de ce gène rend compte à elle seule de 75% de l'ensemble des mutations. Ainsi, ce déficit représente-t-il la surdité génétique la plus fréquente. Son diagnostic moléculaire est utilisable en conseil génétique. La recherche s'oriente maintenant vers l'étude des atteintes de la connexine 26, afin de développer une thérapie appropriée.

Neuropathologie

De nombreuses atteintes du système nerveux liées à des infections virales ou microbiennes sont étudiées dans le cadre de l'étude spécifique de ces agents infectieux.

Dans la rage, première maladie du système nerveux d'origine infectieuse étudiée par Louis Pasteur, la molécule d'adhésion NCAM est un récepteur du virus. Les cellules neuronales et musculaires expriment différentes isoformes de NCAM plus ou moins riches en acide sialique. Les combinaisons des diverses formes de NCAM responsables de l'entrée du virus de la rage dans les cellules nerveuses ont été caractérisées. Par ailleurs, il a été montré qu'une des protéines internes des lyssavirus interagit avec la chaîne légère de la dynéine cytoplasmique ce qui pourrait expliquer le transport axonal rétrograde des lyssavirus. L'utilisation de virus rabiques recombinants permet d'étudier le transport axonal et le passage trans-synaptique du virus rabique, ainsi que les altérations que le virus induit, telle l'ouverture de la barrière méningée. Dans un modèle murin d'encéphalite rabique, la capacité du virus à causer ou non la mort cellulaire programmée (apoptose) détermine l'évolution de l'infection : le niveau d'apoptose en phase précoce de l'infection conditionnerait la dissémination dans le système nerveux central et l'issue fatale ou non de l'infection. La pathogénicité du virus est directement liée à la préservation du privilège immun du système nerveux central : en renforçant ce privilège, le virus achèverait son cycle à l'abri de la réponse immunitaire, pouvant alors, après avoir été inoculé par morsure, transiter dans le système nerveux jusqu'aux glandes salivaires.

Un modèle animal de l'encéphalite et de la démence associées au SIDA a été mis au point chez le rat, et les propriétés neurotoxiques de la protéine Nef du VIH ont été démontrées in vivo. L'étude en IRM fonctionnelle de patients séropositifs pour le VIH a montré qu'ils présentent des déficits cognitifs associés à un dysfonctionnement du cortex frontal.

Enfin, dans un modèle murin de la poliomyélite paralytique, l'apoptose dépendante des caspases explique la destruction des neurones moteurs du système nerveux central. Des travaux visant à élucider la neuropathogénèse induite par HTLV-1 sont effectués, incluant des études immunovirologiques des lésions de patients ayant des paraparésies et l'étude du passage de la barrière méningée par le HTLV-1.

Parasites et parasitologie

D'importants moyens sont consacrés aux relations entre le parasite et son hôte, une étape importante pour identifier les cibles sur lesquelles il est possible d'agir. D'autre part, l'étude de la relation entre système immunitaire, parasite et cellules infectées est un pôle majeur de la recherche en parasitologie.

Paludisme

L'agent du paludisme et son vecteur.

Seuls les moustiques du genre Anopheles permettent le développement de Plasmodium falciparum. A. gambiae est le vecteur majeur en Afrique. Afin d'analyser l'adaptation de P. falciparum aux anophèles, l'absence de réponse immunitaire du tube digestif d'A. gambiae a été étudiée. Le développement de P. falciparum chez le moustique non vecteur, aedes aegypti est bloqué à la traversée de l'épithélium intestinal. Comprendre les modalités de blocage chez A. aegypti devrait permettre d'interrompre la transmission chez A. gambiae. Comme chez tous les insectes, il existe chez A. gambiae une cascade de séryl-protéases responsable de la synthèse de mélanine lors d'une blessure ou de l'invasion d'un corps étranger. Chez A. gambiae, P. falciparum a détourné cette réaction de défense et n'est mélanisé que très rarement. Pour des raisons génétiques, l'activation de la cascade enzymatique est étudiée chez la drosophile qui en possède une identique. Une serpine, inhibitrice naturelle de sérine protéase inhibe l'activation de la cascade, régule aussi la coagulation de l'hémolymphe de l'insecte et est donc impliquée dans les deux mécanismes de défense de l'insecte. On recherche son homologue chez A. gambiae, afin de déterminer si elle y est responsable de l'inhibition de la réponse intestinale.

Jusqu'à présent, on ne connaissait qu'une seule d'une des deux espèces de Plasmodium, parasite du poulet, P. gallinaceum. Cette association hôte-parasite est un système naturel utilisé comme modèle pour des études sur la transmission aux moustiques. Un isolat de l'autre espèce, P. juxtanucleare, a été obtenu au Vietnam, ce qui permet d'élucider les effets de la co-infection de deux espèces sur la transmission du parasite aux moustiques : des co-infections montrent que la présence de P. juxtanucleare diminue la transmissibilité de P. gallinaceum à son vecteur. Ce phénomène semble dû à un croisementfécondation entre les deux espèces qui produirait un zygote non viable.

Le Plasmodium et le globule rouge.

Après sa pénétration dans l'organisme au hasard d'une piqûre par l'insecte vecteur, le parasite doit pénétrer dans les globules rouges. Des activités enzymatiques semblent essentielles à ce processus. La sérylprotéase parasitaire qui assure la dernière étape de maturation de la protéine MSP1 (protéine majeure de surface des mérozoïtes) est indispensable à l'entrée du parasite dans le globule rouge. Cette maturation est probablement assurée par le produit du gène sub2, récemment caractérisé chez P. falciparum et chez des Plasmodium de rongeurs, P. berghei et P. vivax. Au cours de cette année, il a été démontré que sub2 est bien essentiel au cycle érythrocytaire de Plasmodium. Les outils permettant de préciser l'activité enzymatique de la protéine SUB2 ont été développés ainsi que des inhibiteurs spécifiques de SUB2 et d'une autre sérylprotéase parasitaire, qui joue aussi un rôle dans l'entrée du parasite dans le globule rouge. La capacité de peptides à inhiber les activités enzymatiques in vitro ainsi que l'invasion des érythrocytes, permet la conception de pseudopeptides stables, possiblement à activité antiparasitaire.

L'accès pernicieux de paludisme et le paludisme pendant la grossesse semblent liés à la présence à la surface des globules rouges d'adhésines d'origine parasitaire, les protéines Var. L'expression de variants de ces protéines se traduit par une variation antigénique et par des différences dans l'adhérence à l'endothélium vasculaire, des érythrocytes infectés. Le lien entre les deux phénomènes, qui parfois s'accompagne d'une variation du tropisme parasitaire, a été confirmé. Une population parasitaire de cytoadhérence définie n'exprime qu'un seul des 50 gènes var de son génome. Parmi les mécanismes impliqués dans l'expression et la variation des gènes var, les télomères semblent jouer un rôle important ainsi que des réarrangements majeurs au sein de la famille des gènes var. Le positionnement côte à côte de gènes var portés par des chromosomes hétérologues facilite la conversion génique et, du même coup, la diversité des antigènes et des phénotypes d'adhérence. L'adhérence élective d'une sous-population parasitaire à la chondroïtine sulfate (CSA) - récepteur présent en grande quantité au niveau placentaire - est responsable de la susceptibilité des femmes pendant leur première grossesse à l'infection par P. falciparum. Il existe un gène var qui code pour un ligand de CSA, ce qui pourrait déboucher sur une méthode de contrôle du paludisme gestationnel. Les “knobs“, des protubérances résultant de modifications de la membrane de l'érythrocyte induites par le parasite, sont observés aux points d'adhérence avec les cellules endothéliales. Plusieurs protéines parasitaires présentes au niveau des “knobs“ ont été caractérisées. L'étude de la cytoadhérence in vitro, dans des conditions de flux semblables à celles de la circulation sanguine, a montré que les parasites dépourvus de “knobs“, adhérent faiblement aux cellules endothéliales. Les mécanismes de transport et d'adressage de protéines chez P. falciparum sont encore mal connus. Il paraît probable qu'au moins une des protéines d'adhérence migre vers la surface par une voie alternative, différente de la voie classique, ce qui pourrait conduire au développement de nouveaux médicaments.

La réponse de l'hôte au Plasmodium

C'est lors de sa migration vers le foie que le parasite est le plus sensible au système immunitaire. En sus de nombreux travaux sur les protéines de migration/glissement du Plasmodium, des travaux sur la compréhension de la dualité des réponses immunes durant l'infection palustre sont poursuivis. Il a été montré chez des souris infectées par P. yoelii une augmentation très importante des cellules T ab CD4-CD8-NK hépatiques, qui persiste après rémission de la maladie. Ces cellules exerceraient une activité inhibitrice sur le développement du sporozoïte dans le foie.

En ce qui concerne les vaccins antimalaria chez l'homme, on a pu montrer qu'un antigène du stade pré-érythrocytaire induit une réponse protectrice chez le primate infecté par P. falciparum. Les premiers essais cliniques ont débuté en janvier 2001 chez 36 volontaires. Une stratégie alternative consiste à utiliser un fragment de l'antigène MSP1 de Plasmodium dont la structure tridimensionnelle en complexe avec un anticorps spécifique a été déterminée. Des résultats convaincants chez le primate font de cet antigène un candidat vaccinal pour P. falciparum qui devrait bientôt être en essai de phase I chez l'homme. Des études de terrain sur la diversité de P. falciparum et ses conséquences sur la réponse immune révèlent deux faits marquants. D'une part, l'examen du sang périphérique pourrait ne pas refléter exactement l'état de l'infection et, d'autre part, l'étude au fil du temps de la réponse anticorps aux régions très polymorphes de MSP1 révèle un profil de réactivité assez conservé et un manque de nouvelles spécificités d'anticorps en dépit d'une accumulation de plusieurs variants du Plasmodium. Ce phénomène semble refléter une stratégie d'échappement à la réponse immune. Enfin, une étude sur la contribution possible des lymphocytes gd à la pathologie associée à P. falciparum, a révélé que chez les enfants africains infectés, ces cellules sont activées et produisent respectivement des hauts niveaux de INF-g et TNF-a.

Leishmania, Trypanosoma et Taileria

Les vecteurs hématophages chez lesquels les leishmanies réalisent une partie de leur cycle, peuvent prendre leur repas sanguin chez l'homme : si elles hébergent des leishmanies, elles inoculeront des parasites invasifs dans le compartiment cutané où les parasites créent, remodèlent un environnement permissif à leur développement, ce jusqu'au stade “parasites transmissibles“ aux vecteurs. Des modèles originaux ont été définis pour caractériser les étapes qui soustendent la multiplicité des processus que déclenchent les leishmanies chez leurs hôtes mammifères, depuis l'inoculation initiale dans le derme jusqu'au stade de la transmission au vecteur. Les recherches sur Trypanosoma cruzi visent à comprendre les mécanismes qui contribuent de manière paradoxale à l'induction par le parasite d'une immunosuppression d'abord puis d'auto-immunité. L'activité immunosuppressive semble être associée à la sécrétion par le parasite d'une proline-racémase qui active fortement de manière polyclonale les lymphocytes B naïfs. Cette racémase pourrait représenter une cible thérapeutique nouvelle. L'analyse du répertoire B de la souris résistante ou sensible après et avant infection par T. cruzi a montré que le répertoire B chez la souris résistante est paradoxalement composé d'anticorps multiréactifs et anti-“soi“ ce qui pourrait maintenir une autoréactivité “physiologique“ et empêcher le développement d'une auto-réactivité sévère.

La stratégie par laquelle le parasite bovin Taileria parva transforme les lymphocytes B est étudiée. T. parva cible une activité phosphatase et contrôle ainsi l'induction de facteurs de transcription et l'apoptose de la cellule-hôte. En outre, les lymphocytes infectés par T. parva présentent une activité enzymatique particulière essentielle pour la transformation, probablement par induction d'une prolifération continue.

Physiologie microbienne et environnement

L'étude de la réponse des bactéries à leur environnement est une constante de la microbiologie à l'Institut Pasteur depuis plus de cinquante ans. Elle ne cesse de s'approfondir grâce aux techniques modernes de génomique et à l'analyse de transcriptomes.

Membranes bactériennes et sécrétion des protéines

La circulation de molécules au travers de la paroi et la membrane bactérienne, vitale pour une bactérie, est en même temps un enjeu biotechnologique. L'activation des gènes impliqués dans le transport et le métabolisme du maltose et des maltodextrines chez Escherichia coli et la sécrétion du produit d'un de ces gènes, la pullulanase de Klebsiella oxytoca sont très étudiés. Le premier processus dépend de l'activateur transcriptionnel MalT activé par le maltotriose et réprimé par trois autres protéines. Le second implique les douze protéines du complexe membranaire qui transporte la pullulanase à travers la membrane. Le choix de ces deux systèmes se justifie par l'existence de systèmes homologues chez de nombreuses bactéries. Les approches génétiques sont complétées par des analyses structurales fines. Les transporteurs ABC des bactéries à Gram- transportent des protéines dépourvues de peptide signal mais pourvues d'un signal de sécrétion en fin de protéine. Ils sont constitués de trois protéines de l'enveloppe bactérienne : la protéine ABC qui apporte de l'énergie, et deux protéines auxiliaires. La protéine ABC forme un complexe avec la protéine à sécréter, les trois composants du transporteur et des protéines protectrices dites “chaperones”, variables selon les protéines.

Le cas des hémophores est très étudié. Ce sont des protéines capables de lier l'hème libre et d'extraire l'hème de protéines comme l'hémoglobine, puis de délivrer l'hème à un récepteur spécifique. L'hémophore HasA de Serratia marcescens est dirigé vers le transporteur grâce à la chaperone SecB et reste sous une forme “sécrétable“ jusqu'à ce que son extrémité C-terminale soit synthétisée et que son signal de sécrétion soit reconnu par le transporteur. La structure dans l'espace de l'hémophore montre un nouveau type de site de fixation pour l'hème et le fer. L'interaction entre l'hémophore et son récepteur se fait par contact entre les deux protéines sans intervention de l'hème. Comme les hémophores chargés ou non d'hème se lient au même site sur le récepteur et avec la même affinité, il y aurait simplement échange entre hémophore chargé et hémophore vide fixé sur le récepteur.

Contrôle du métabolisme bactérien et virulence

L'adaptation du métabolisme bactérien aux variations de l'environnement est déterminée par une génétique complexe qui ne cesse d'être étudiée. La réponse génétique totale à des variations de l'environnement est abordée par l'étude du transcriptome chez B. subtilis et S. aureus. Cette stratégie a permis d'identifier les jeux de gènes qui répondent de façon coordonnée à un même événement.

De nombreuses études portent sur le contrôle du métabolisme de l'azote et des sucres, d'autres sur la résistance aux agressions. Le stress thermique induit en effet l'expression de protéines, dits de choc thermique, qui assurent la protection des enzymes clefs de la physiologie microbienne, mais qui sont aussi liées à la pathogénicité. Le contrôle de leur expression a été très étudié dans de nombreux microorganismes. Les gènes de choc thermique codant pour les sous-unités catalytiques et régulatrices de la protéase ATP-dépendante de B. subtilis sont sous le contrôle du répresseur CtsR. Il se trouve que la protéine CtsR et ses séquences cibles sont fortement conservées parmi les bactéries Gram+ à faible contenu en GC, dont certains pathogènes (Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae Enterococcus fæcalis) ce qui suggère une physiologie commune. Chez S. pneumoniae, l'expression des protéines chaperones GroESL dépend à la fois de CtsR et d'un autre régulateur global, qui font l'objet d'un même système de régulation. Des systèmes voisins et de complexité variable ont été identifiés dans diverses autres bactéries.

L'analyse génétique de la virulence bactérienne a été poursuivie. Chez S. aureus, un système à deuxcomposants, ArlS/ArlR, intervenant dans la virulence de cette bactérie, a été analysé et sa délétion provoque une très forte augmentation de la protéine A fixatrice des molécules d'anticorps. Un régulateur pléiotrope de l'expression des facteurs de virulence en activant la transcription d'au moins 15 gènes codant des protéines extracellulaires (phospholipases C, protéases, hémolysine, entérotoxines). L'interruption de ce gène diminue fortement les propriétés hémolytiques et cytolytiques de B. thuringiensis et B. cereus. Chez la souris, la mortalité causée par les spores de ces bactéries, est fortement diminuée voire abolie chez le mutant plcR. L'expression de plcR est autorégulée, contrôlée négativement par un gène de sporulation, et dépend également d'un transporteur ABC impliqué dans la perméation de petites protéines.

Mécanismes et supports de résistance aux antibiotiques

La génétique et la biochimie de la résistance bactérienne aux principales familles d'antibiotiques utilisées ou en développement (fluoroquinolones et streptogramines) sont étudiées chez les bactéries pathogènes majeures pour l'homme.

L'étude de certains déterminants de résistance a permis de mettre au point des techniques génotypiques sensibles permettant l'identification simultanée des bactéries et des mécanismes de résistance associés chez les bactéries Gram+ et Gram-.

Enfin, l'étude des transferts d'information génétique de bactéries aux cellules de mammifères est poursuivie du fait de son intérêt potentiel en thérapie génique et pour la stimulation de l'immunité mucosale. Les travaux sur les staphylocoques sont axés sur la résistance aux streptogramines et aux antibiotiques apparentés. Un variant du gène codant une protéine ABC qui confère la résistance à la streptogramine A a été dernièrement caractérisé. Il est véhiculé par un élément génétique mobile. Le laboratoire mixte Pasteur-Necker de recherche sur les streptocoques a étudié la dissémination de la résistance aux antibiotiques chez les cocci. La première souche de streptocoques (S. bovis) hautement résistante à la vancomycine a été caractérisée et le rôle des transposons dans la dissémination de la résistance a été démontré. L'analyse du transposon Tn916 du streptocoque a révélé que la transcription de ses fonctions de transfert requiert l'excision de l'élément et augmente dramatiquement en présence de tétracycline. Ces résultats montrent un degré de complexité supplémentaire de la résistance aux antibiotiques, car ces derniers peuvent aussi induire le transfert de gènes de résistance.

L'isoniazide est un puissant agent antituberculeux dont la toxicité résulte de sa transformation par une réaction enzymatique. D'importants progrès ont été réalisés dans la compréhension de ce mécanisme. Le pouvoir pathogène de certains isolats cliniques isoniazido-résistants a été évalué dans un modèle animal. Par ailleurs, l'évaluation sur le terrain d'un test de détection moléculaire des bacilles de la lèpre résistants à la rifampicine a donné des résultats tout-à-fait satisfaisants.

Micro-organismes et environnement

Apparues sur notre planète il y a environ 3 milliards d'années, les cyanobactéries ont été les premiers organismes à utiliser l'eau comme source de pouvoir réducteur et la lumière comme source d'énergie. Elles sont responsables de l'enrichissement en oxygène de l'atmosphère primitive et sont considérées comme les ancêtres des chloroplastes. Ce sont aussi d'excellents modèles bactériens pour l'étude des fonctions cellulaires intégrant changements morphologiques et fonctionnels en réponse à des variations de lumière ou de conditions nutritionnelles dans l'environnement.

Les photorécepteurs et leur fonction, et celle de protéines impliquées dans les voies de transmission des signaux nécessaires à la coordination des voies métaboliques du carbone et de l'azote sont étudiés.

Une collection de cyanobactéries, “Pasteur Culture Collection“, avec plus de 720 souches appartenant à 50 genres différents issus d'écosystèmes variés, est sans cesse améliorée. Les “spirulines”, cyanobactéries très exploitées industriellement, et des souches pathogènes, productrices d'hépatotoxines et de neurotoxines mortelles pour l'animal et pour l'homme y sont conservées. Des études sont menées pour identifier, en culture et in situ, des cyanobactéries potentiellement toxiques, en particulier celles du genre Microcystis qui envahissent les eaux dormantes pendant la période estivale.

Un autre groupe étudie les bactéries fixatrices d'azote et particulièrement des fonctions cellulaires qui permettent à ces bactéries de fixer l'azote dans leur environnement particulier. On s'intéresse à la production d'une phytohormone, l'acide indole acétique, par Azospirillum brasilense, une bactérie fixatrice d'azote associée aux cultures céréalières. Trois voies de synthèse différentes sont impliquées dans la synthèse de cette hormone à partir du tryptophane. On a poursuivi l'étude d'un Pseudomonas stutzeri fixateur d'azote et endophyte du riz.

La biodégradation des isoalcanes et des éthers-carburants relève de la lutte contre les pollutions par les hydrocarbures. Ces composés, parmi les plus récalcitrants des composants de l'essence, posent un problème pour la restauration biologique des sites pollués. Les enzymes et les gènes des voies de dégradation sont étudiés chez Mycobacterium austroafricanum et chez Gordonia terrae, deux espèces de mycobactéries. Un groupe de gènes responsables de la dégradation de l'éthyl tert-butyl éther a été cloné et séquencé chez G. terrae. Ce résultat permet d'envisager le développement d'outils (sondes d'acides nucléiques, souches porteuses de gènes rapporteurs) afin de mieux évaluer le potentiel de biodégradation et l'évolution de la flore microbienne des sites pollués par l'essence.

Lutte microbiologique contre les insectes

Chez les larves du moustique Culex pipiens, un récepteur spécifique de la toxine binaire (Bin) produite par Bacillus sphaericus est présent sur les membranes intestinales. Ce récepteur a été cloné et exprimé de manière fonctionnelle dans des cellules d'insectes. Le composant BinA de la toxine est capable de s'insérer dans des membranes phospholipidiques et d'y former des pores, confirmant son rôle de composant actif de la toxine, la partie BinB étant quant à elle responsable de la fixation sur le récepteur spécifique.

Des populations de C. pipiens développent des résistances à la toxine binaire de B. sphaericus. Plusieurs mécanismes de résistance cohabitent dans des populations géographiquement proches. Afin de trouver de nouvelles toxines actives, un certain nombre de toxines de B. thuringiensis ont été éprouvées. Les protéines Cry29A et Cry30A ne sont pas actives individuellement sur les larves de moustiques aedes aegypti, Culex pipiens et Anopheles stephensi, mais semblent agir en synergie avec d'autres toxines de B. medellin, sur ces trois espèces. La protéine Cyt2Bc est toxique pour les 3 espèces de moustiques et présente une activité hémolytique après activation par la trypsine. Trois toxines de B. thuringiensis se sont révélées toxiques sur des larves de C. pipiens résistantes aux toxines de B. sphaericus ou de Bt israelensis. Un B. sphaericus recombinant produisant la protéine Cry11Bb de B. jegathesan, actif contre les larves d'aedes aegypti a été construit et placé sous le contrôle des séquences promotrices fortes de B. sphaericus.

Du côté des champignons entomopathogènes, la diversité des espèces de Zygomycètes s'attaquant aux insectes a fait l'objet d'études au laboratoire et sur le terrain. L'analyse moléculaire des souches originales provenant de Grèce a souligné la parenté entre Erynia neoaphidis, considérée comme un pathogène spécifique de pucerons, et E. dipterigena, considérée comme un pathogène spécifique des Diptères. Chez cette dernière espèce, le typage moléculaire a permis de mettre en évidence une variabilité infraspécifique géographique. Une mission de prospection en Afrique de l'Ouest a conduit à étudier pour la première fois les champignons entomopathogènes en Guinée. Les zones de moyenne altitude du Fouta Djalon semblent particulièrement favorables à la manifestation, parfois à l'état épizootique, de mycoses à Entomophthorale ou à Hyphomycète dans les populations d'insectes de différents ordres. Le genre Zoophthora, peu fréquent sous les tropiques, y a été notamment rencontré. Des souches en ont été isolées de divers Homoptères pour analyse ultérieure.