Clonage par recombinaison in vitro

Origine de la technologie

De façon à pouvoir manipuler plusieurs dizaine de gènes à la fois, le clonage est réalisé grâce à une technologie permettant sa standardisation : la technologie GATEWAY™ commercialisée par la société Invitrogen.

Celle-ci met en jeu des transferts d’ADN entre différents vecteurs grâce à des recombinaisons sites spécifiques.

Elle s’inspire du processus naturel d’intégration/excision du phage lambda dans/du génome d’Escherichia coli.

Les sites naturels de recombinaisons attB, L, R et P ont été modifiés de façon à augmenter l’efficacité de recombinaison et à permettre le clonage directionnel.
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Réactions de recombinaisons entre le phage lambda et E. coli.
La réaction attP x attB (intégration) est catalysée par les enzymes Int (intégrase), et IHF (factor d’intégration). Une enzyme supplémentaire, l’excisionase (Xis) intervient dans la réaction d’excision attL x attR.
Int, Xis sont codées par la génome du phage, alors que IHF est une protéine d’E. coli.

Etapes du clonage par recombinaison in vitro

La première étape consiste à obtenir l’ORF à clôner avec, à chacune de ses extrémités, deux sites de recombinaison attB : attB1 et attB2. Ces deux sites sont légèrement différents l’un de l’autre, ce qui permet d’assurer tout au long du processus un clonage directionnel.

Cette opération est réalisée par une réaction de PCR utilisant un couple de primers dont les extrémités 5’ sont constituées par les séquences attB1 et attB2.

Il s’agit lors de la deuxième étape de sous cloner le produit de PCR obtenu par une première réaction de recombinaison. On obtient alors un « clône d’entrée » dans lequel l’ORF est maintenant flanquée de deux sites attL : attL1 et attL2.

La troisième étape est une incubation, sans purification du clone d’entrée, avec le « vecteur de destination » pDESTTM17. Ce vecteur d’expression est munis des sites attR1 et attR2 recombinant spécifiquement avec les sites attL1 et attL2, permettant ainsi l’obtention d’un« clône d’expression ».
Le produit de cette seconde et dernière étape est utilisé pour transformer le souche bactérienne BL21 (DE3) pLysS.
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Technologie Gateway™
Le produit de PCR bordé des séquences de recombinaison attB est sous cloné dans un vecteur donneur (réaction BP), avant d’être transféré dans un vecteur d’expression (réaction LR).
pDONR201™ est le vecteur donneur utilisé sur la plate forme 6, et pDEST17™, le vecteur de destination.

Structure primaire des protéines recombinantes

Le vecteur pDESTTM17 permet de fusionner la séquence du gène cible avec un tag polyhistidine. L’expression est gouvernée par le promoteur fort du bactériophage T7.

Inhérent à la technique de clonage utilisée, la protéine recombinante possède, en N-terminal, 21 acides aminés surnuméraires par rapport à la protéine native. Ceux-ci sont majoritairement dus à la séquence de recombinaison attB1 et au tag histidine.

C’est pourquoi aujourd’hui, nous introduisons systématiquement dans nos constructions une séquence sensible à la protéase TEV entre l’ORF et la séquence de recombinaison attB1. L’ajout de ce site est réalisé lors de l’étape de PCR, et permet, après digestion de la protéine recombinante, d’éliminer 20 des 21 acides aminés ajoutés.
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Structure des protéines recombinantes
Avant l’introduction (lors de l ‘étape de PCR) du site sensible à la TEV, les protéines possédaient 21 acides aminés supplémentaires par rapport à la protéine native