Sur un histogramme comment éloigner 2 spots qui sont très rapprochés ?


Un histogramme biparamétrique ("dot-plot") peut montrer 2 populations à la moyenne de fluorescence très proche. Cela se traduit par 2 nuages de points proches et dont la séparation est difficile à déterminer. Il est alors souhaitable de pouvoir éloigner ces 2 nuages; par exemple pour pouvoir compter le nombre de cellules appartenant à chacun.


Si 2 spots de fluorescence sont très rapprochés cela veut dire que la moyenne de fluorescence des cellules correspondantes est très proche.

Pour" éloigner" les 2 spots, plusieurs possibilités peuvent être explorées, et appliquées en tout ou partie. Il s’agit d’abord d’analyser d’où peut provenir le problème.


S’il s’agit de mieux séparer les cellules positives et négatives et que le problème semble venir du fait que les cellules négatives sont "légèrement positives" :

Vérifiez que la quantité d’anticorps que vous avez ajoutée dans le mélange réactionnel n’est pas trop élevée. En diminuant la quantité d’anticorps, le spot "négatif" important va se rapprocher de l’origine.

S’il s’agit de mieux séparer les cellules positives et négatives et que le problème semble venir du fait que les cellules positives sont trop faiblement marquées :

Amplifiez le signal en utilisant un anticorps biotinylé et révèlez-le par la streptavidine fluorochrome ( 1 biotine fixe 4 streptavidines ): vous devez augmenter le signal positif sans modifier le signal négatif. 

Dans tous les cas, si vous êtes en amplification linéaire linéaire passez en amplification log.

Faites un double marquage en utilisant un anti isotype marqué dans une autre couleur.

Attention !

En aucun cas vous ne pourrez éloigner les spots en augmentant le voltage ou le gain des PMT. Vous n’aboutiriez dans ce cas qu’à une translation qui déplacerait l’ensemble.

Par ailleurs, s’il existe un "continuum ininterrompu de valeurs" entre 2 populations, il sera difficile de fixer la limite entre les 2, quoi que vous fassiez.

Enfin, il est toujours préférable de chercher à séparer les 2 sous-populations en modifiant les conditions de marquages, plutôt qu’en utilisant les modes de représentation sur l’écran qui ne sont que des artifices, certes pratiques, mais qui peuvent être trompeurs en mettant en évidence certains aspects et en dissimulant les autres.