Laser

Intérêt de l'utilisation des lasers en cytométrie


Les lasers présentent l’intérêt d’émettre une lumière monochromatique (c’est à dire selon un, ou plusieurs, spectres très étroits), donc d’une couleur très pure, ce qui permet d’exciter spécifiquement une molécule donnée sans exciter une autre molécule, même si les spectres d’excitation de ces deux molécules sont proches. Par ailleurs le faisceau lumineux du laser est très fin, ce qui permet de le focaliser sur une seule cellule à la fois, et limite beaucoup le "bruit de fond". Enfin, toute l’énergie produite est concentrée sur une petite surface, ce qui évite les déperditions spatiales.

L’excitation lumineuse est donc très puissante. Selon les longueurs d’onde nécessaires pour exciter le fluorochrome, on choisira un type de laser ou un autre.

Pour la CMF, le type de laser le plus employé est le laser à ions Argon. On emploie également les lasers krypton, hélium-cadmium et hélium-néon.

Cependant, l’emploi d’un laser présente quelques inconvénients, puisqu’il limite forcément le choix des longueurs d’ondes utilisables.


Pour palier cet inconvénient, les lasers à colorants peuvent être utilisés. En effet, ceux-ci sont en réalité composés par 2 modules : un premier laser identique à ceux que nous décrivions ci-dessus, mais dont la lumière est captée pour exciter un colorant qui est un fluorochrome. Ce dernier circule en permanence devant le faisceau. C’est la lumière émise par ce colorant qui sera utilisée par le cytomètre est viendra frapper les cellules. Ainsi, il suffit de choisir un colorant adapté pour avoir accès à une gamme de longueur d’onde convenable. Cependant, malgré l’attrait qu’ils ont suscité il y a quelques années, les lasers à colorant n’ont pas connu un grand développement en CMF. Cela est sans doute en partie explicable par leurs prix élevé, leur taille et leur manipulation délicate.

Une autre possibilité se présente : celle d’utiliser comme source d’éclairement une lampe Xe ou à vapeur de mercure. Dans ce cas, la gamme de longueur d’ondes est très étendue. L’inconvénient est cependant que la puissance est beaucoup plus faible que celle du laser, et que la focalisation du faisceau oblige à interposer des lentilles qui absorbent forcément un peu de lumière. Par ailleurs, ces lampes ont une durée de vie plus limitée que celle d’un laser. Bien que présentant un certain attrait, les appareils ainsi équipés ne se sont pas beaucoup développés.

En réalité, le LASER en Cytométrie semble avoir de beaux jours devant lui, puisque des solutions sont progressivement apportées aux principaux inconvénients que nous avons signalés. Ainsi, la puissance nécessaire diminue, ce qui permet d’utiliser des "diodes-lasers" et des lasers refroidi par air, moins coûteux et moins contraignants. Mais la meilleure façon actuelle de répondre à cet inconvénient est sans conteste principal "atout" est l’apparition de réactifs "tandem" . couplés à des colorants de plus en plus nombreux et compatibles avec les lasers classiques. Ces nouveaux colorants reposent souvent sur le principe du transfert d’énergie et sont de plus en plus utilisés dans le domaine de l’immunofluorecence.