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Services

Séquençage ADN

Contact : pf8-seq@pasteur.fr

Ce service est proposé aux entités pasteuriennes impliquées dans la santé publique et aux CNR hors Institut Pasteur dans un contexte de bio-urgence et/ou épidémique majeur.

Informations générales

Les réactions sont réalisées à la plate-forme à partir de produits PCR (majoritairement), RT-PCR, matrices ADN/ARN ou plasmides envoyés par les entités demandeuses. En cas de besoin, la plate-forme peut intervenir plus en amont, en réalisant les PCR ou RT-PCR sur les matrices fournies par les CNR. Les produits d’amplification sont purifiés par ultrafiltration (Millipore) et leurs concentrations déterminées sur gel d’agarose ou par dosage direct (Nanodrop). Les réactions de séquence sont alors préparées (kit Big Dye Terminator v1.1) manuellement en microplaques de 96 puits. Les réactions de séquence sont purifiées par précipitation à l’éthanol. Les chromatogrammes obtenus par passage sur capillaires (séquenceur automatique ABIPRISM 3730XL DNA analyzer) sont vérifiés puis immédiatement mis à disposition des laboratoires sur un serveur informatique dans des répertoires protégés spécifiques à chaque entité. Les laboratoires sont prévenus de la disponibilité de leurs séquences par message électronique.
Le service de séquençage à façon accepte des nombres d’échantillons très variables. Ce service n’est pas destiné au haut débit.

Informations sur les échantillons

Réception et conditionnement des échantillons :
Préciser le degré d’urgence afin de permettre à la PF8 d’établir des priorités pour le traitement des échantillons.
   -Réception des échantillons tous les jours ouvrés de la semaine
    -Conditionnement des échantillons : si possible micro-plaque 96 puits ou barrette de 8 micro-tubes 0.2 ml avec un volume minimum de 25 µl par échantillon
Expédition des échantillons : Avant d’apporter les échantillons,  envoyer la feuille de route (fichier Excel à télécharger) par courrier électronique à l’adresse suivante : pf8-seq@pasteur.fr . Les échantillons sont déposés à la plate-forme (Bâtiment BioTop, 1er sous-sol) accompagnés d’un bon de cession interne signé par le gestionnaire
Qualité des échantillons : Le contrôle de la taille et de la concentration des produits PCR doivent avoir été faits au préalable par le demandeur (photo des gels à fournir éventuellement à la PF8),
Concentration des échantillons :
- 20 à 60 ng pour un produit PCR / réaction de séquence
- 150 à 200 ng pour un plasmide / réaction de séquence
dans un volume compris entre 1 µl à 7 µl
Prise en charge des oligonucléotides d’usage courant : La plate-forme se charge de renouveler les stocks d’oligonucléotides utilisés régulièrement pour réaliser les séquences. Si de nouveaux oligonucléotides sont à utiliser, les CNRs doivent dans ce cas les apporter avec les échantillons
Purification des produits PCR : La purification des produits PCR est assurée par la plate-forme par un système d’ultrafiltration sur membrane ( produit PCR > 150pb ) sinon préciser la taille des produits PCR afin d’adapter le système d’ultrafiltration
Conservation des échantillons : Les plaques de réactions de séquence sont conservées 1 jour après passage sur séquenceur et peuvent en cas de problème être réutilisées pour un run supplémentaire.
Les produits PCR purifiés sont conservés 3 mois à la plate-forme pour reséquençage éventuel.

Les résultats

Délai : L’ensemble du processus depuis la réception jusqu’à la mise à disposition des séquences prend en moyenne 48h. En cas de bio-urgence, les résultats sont disponibles en moins de 24h.
Transmission des résultats : Lorsque les séquences sont disponibles, le demandeur est informé par courrier électronique. Les séquences sont mises à disposition dans le répertoire de l’entité concernée  (/mount/CNR/…) ou envoyées via un système de transfert de fichiers (uploads.pasteur.fr). En cas de mauvaise qualité des séquences, le demandeur est prévenu et les données sont toutefois transmises.
 Sauvegarde des données : Une sauvegarde des séquences est conservée par la plate-forme pendant une durée de 6 mois.

Tarifs

2.50 € par séquence soit 240 € pour une microplaque 96 puits

Microsatellites / VNTR

Contact : pf8-seq@pasteur.fr

La plate-forme offre un service d'analyse de fragments pour le typage des mini- et micro-satellites (Variable Number of Tandem Repeats (VNTR), Multilocus VNTR Analysis (MLVA)). La migration sur capillaires est réalisée sur le séquenceur ABI PRISM 3730XL avec un temps de passage d’environ une heure. La plate-forme met également à disposition des utilisateurs de ce service le logiciel GeneMapper version 4.0 (Applied Biosystems) permettant une analyse facile et conviviale des données.