Technologies

Séquençage à très haut débit (Illumina)

Depuis octobre 2010, la Génopole de l’ Institut Pasteur a fait l’acquisition d’un séquenceur à très haut débit, le HiSeq 2000, commercialisé par Illumina.

Cet appareil est couplé à une machine cBot (Illumina) pour la préparation des lames support du séquençage (flowcell).

Depuis février 2013, la plate-forme est également équipée d'un MiSeq (Illumina).

Installés à la Plate-forme de séquençage (PF1), ces appareils sont utilisés conjointement par PF1, par la plate-forme Transcriptome et epigénome ( PF2) et par la plate-forme de Génotypage et Santé publique (PF8).

         Genome analyser Solexa                    



Schématiquement, le HiSeq permet de déterminer 100 000 000 de séquences de 50 à 100 bases par échantillon en quelques jours, soit l'équivalent de 5-10 Gigabases de séquence. Chaque run correspond à 8 expériences indépendantes.


Le MiSeq ne traite que 2 échantillons simultanément, mais peut produire 0,8 Gigabases de séquence en quelques heures. Il permet également la réalisation de lectures plus longues ( jusqu'à 250 bases).

Illumina prévoit une amélioration expérimentale (chimie plus performante, augmentation de la surface des supports de séquençage) et logicielle (optimisation de l'analyse d'images, réduction de la taille des fichiers de données...) qui devrait porter le nombre de lectures à 3 milliards de lectures par expérience (exemple: un run de 100 cycles qui produit 3 milliards de séquences permet de séquencer de fait 300 Gigabases, soit 100 000 genomes de Listeria ou 100 génomes humains!).

 
Les séquenceurs Illumina permettent le reséquençage et le comptage des molécules d’acides nucléiques.
En fonction de la question biologique posée, différentes options sont proposées : le séquençage peut être directionnel ou non, centré sur les sites d’initiation de la transcription ou sur l’entièreté des transcrits, la longueur des lectures peut être de 50 ou 100 bases en single reads ou en paired ends, les échantillons peuvent être multiplexés.


La plate-forme prend en charge les acides nucléiques (ADN, ARN), réalise la préparation des librairies puis le séquençage, et, selon les souhaits des collaborateurs, fournit les données brutes de séquençage ou une analyse compléte (filtrage qualité, suppression des séquences d'adaptateurs, alignements sur les génomes de référence, normalisation, analyse statistique différentielle...).

Affymetrix

La Société Affymetrix offre une solution clé en main pour l’étude de l’expression génique chez plus de 25 espèces différentes comprenant des puces pan génomiques à oligonucléotides, des protocoles et des réactifs standardisés, une automatisation du lavage et du scanning des Genechip et des logiciels d’analyse. PF2 prend en charge l’ensemble des étapes depuis la préparation des sondes à hybrider à partir des acides nucléiques jusqu’à l’extraction des données.

Genechip® Expression arrays

4 types de Genechip sont proposés par la platefrome Affymetrix pour une analyse transcriptionnelle :

  • Puces 3' Expression

Sur ces Genechip Affymetrix, chaque transcrit est interrogé par un jeu de 11 à 16 paires d'oligonucléotides distincts. Les oligonucléotides d'une longueur de 25-mer sont dirigés préférentiellement contre la région 3' des ARN messagers, proche de la queue polyA.

Les Genechip 3' ne sont plus proposées aux collaborateurs si une Genechip WT existe pour votre étude.

  • Puces WT (Whole Transcript) Gene ST

Les Genechip Gene ST (version 1.0 ou 2.0) interrogent les transcripts les mieux annotés d'un génome.
Sur ces Genechip, chaque gène est représenté par environ 25 oligonucléotides dirigés contre les exons et répartis sur toute la longueur du gène.

  • Genchip WT Exon ST

Sur ces Genechip, chaque exon d'un gène est représenté par environ 4 sondes.
Le contenu de ces Genechip permet l'analyse différentielle d'expression des gènes et la recherche de splicing alternatif.

PF2 dispose d'un scanner GeneChip pour la lecture des puces Exon à très haute densité. Nous prenons en charge l'ensemble des étapes depuis la préparation des sondes jusqu'à l'analyse des données d'expression.

L'équipement permet de réaliser 24 hybridation par jour.

  • miRNA Genechip

Les Genechip miRNA sont en constante évolution. Veuillez contacter la plateforme pour obtenir les dernières innovations Affymetrix

Genechip miRNA (plus disponible)
Genechip miRNA 2.0
Genechip miRNA 3.0

Affy_chips

Analyse statistique des données Affymetrix

Les données de transcriptome sont préférentiellement analysées par le logiciel R et l'utilisation de package BioConductor.