Protocoles (au 10 Decembre 2008)

Type de matrice	Quantité nécessaire
Produit PCR 200 -500 bp 500 - 1000 bp 1000 - 2000 bp > 2000 bp	8 - 10 ng 15 - 20 ng 10 - 40 ng 30 - 50 ng
ADN Plasmidique de 4.5 à 8 kb ± 15 kb	75-150 ng 200 à 500 ng
Cosmide, fosmide (`± 40 kb)	0.5 - 1.0 µg
BAC	1.5 à 2 µg
ADN génome bactérien	2 - 3 µg

Mélange réactionnel pour une réaction de séquence dans un volume final de 10 µl :

Réactifs	Produit PCR 200-500 pb	Produit PCR 500-1000 pb	Produit PCR >1000 pb	ADN plasmidique
Amorce à 4 µM	1 µl	1 µl	1 µl	1 µl
ABI Prism solution version 3.1 ou 1.1	0.5  µl	0.8 µl	1 µl	1 µl
Tampon 5 X	2 µl	2 µl	2.5 µl	2 µl
matrice	cf tableau sus-cité	cf tableau sus-cité	cf tableau sus-cité	cf tableau sus-cité
H2O	qsp 10 µl	qsp 10 µl	qsp 10 µl	qsp 10 µl

Ne jamais mettre plus de 1 µl de ABI Prism solution


Mélange réactionnel pour une réaction de séquence dans un volume final de 20 µl :

Réactifs	Fosmide/Cosmide	ADN BAC
Tampon 5X	3.5 µl	3.5 µl
ABI Prism solution version 3.1 ou 1.1	2 µl	2 µl
Amorce à 10 µM	1 µl	1 µl
matrice	cf tableau sus-cité	cf tableau sus-cité
H2O	qsp 20 µl	qsp 20 µl

• Programme utilisé pour une machine GeneAmp 9700 :

Pour des réactions de séquences à partir de produits PCR et ADN plasmidique :
96°C 1 min
96°C 10 sec }
50°C 5 sec } 25 à 35 cycles
60°C 4 min }


Pour des réactions de séquences à partir de matrices Cosmide, fosmide, BAC:
98°C 2 min
95°C 20 sec }
53°C 10 sec } 50 cycles
60°C 3 min }
72°C 5 min

et dans les deux cas :

15°C for ever
Conserver la plaque à 4°C ou à -20°C