Genopole / Plates-formes / PF1 - Génomique

Protocoles (au 10 Decembre 2008)

Réactions de séquence en plaque 96 puits - Recommandations

1. Réactifs et produits

  • ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit version 3.1 (Applied Biosystems réf. 4337456, magasin général réf. 99219 )
  • ou version 1.1 (Applied Biosystems réf. 4337451, magasin général réf. 98150) à stocker à -20 °C
  • Tampon 5X (fourni avec le Kit version 3.1, Applied Biosystems) à stocker à + 4°C
  • Plaque 96 puits (ABgene ref. AB1100, magasin général ref. 42741) ou 4titude Dutscher (Dutscher réf : 044754)
  • H2O filtrée type MilliQ Synthesis (Millipore)
  • Ethanol absolu
  • Acétate de sodium 3M pH 5,2
  • EDTA 125 mM pH 8

Recommandations

  • Il est impératif de mettre les échantillons en colonnes ( de A1 à H1 et ensuite de A2 à H2 etc……) et non en ligne.
  • Ecrire sur la tranche de la plaque la référence et la version de la chimie utilisée (v1.1 ou v3.1)
  • Vérifier les quantités et la qualité  des matrices par une mesure des absorbances (DO 260, DO 280, DO 230) et par un dépôt et migration sur gel d'agarose

2. Protocoles

2-1 Protocoles pour les réactions de séquence : ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready -version 3.1 ou version 1.1

  • Ces protocoles sont standardisés et peuvent être adaptés au besoin après le résultat d’un premier passage sur le séquenceur:
  • Type de matrice
    Quantité nécessaire
    Produit PCR
    200 -500 bp
    500 - 1000 bp
    1000 - 2000 bp
    > 2000 bp

    8 - 10 ng
    15 - 20 ng
    10 - 40 ng
    30 - 50 ng
    ADN Plasmidique
    de 4.5 à 8 kb
    ± 15 kb

    75-150 ng
    200 à 500 ng
    Cosmide, fosmide (`± 40 kb)
    0.5 - 1.0 µg
    BAC
    1.5 à 2 µg
    ADN génome bactérien 2 - 3 µg


  • Mélange réactionnel pour une réaction de séquence dans un volume final de 10 µl :

  • Réactifs
    Produit PCR 200-500 pb
    Produit PCR 500-1000 pb
    Produit PCR >1000 pb ADN plasmidique
    Amorce à 4 µM
    1 µl
      1 µl 1 µl 
    1 µl 
    ABI Prism solution version 3.1 ou 1.1
    0.5  µl
    0.8 µl   1 µl
    1 µl  
    Tampon 5 X
    2 µl
    2 µl 
     2.5 µl
      2 µl 
    matrice
    cf tableau sus-cité
    cf tableau sus-cité
    cf tableau sus-cité
    cf tableau sus-cité
    H2O
     qsp 10 µl
    qsp 10 µl
    qsp 10 µl
    qsp 10 µl

    Ne jamais mettre plus de 1 µl de ABI Prism solution


    Mélange réactionnel pour une réaction de séquence dans un volume final de 20 µl :

    Réactifs Fosmide/Cosmide ADN BAC
    Tampon 5X  3.5 µl   3.5 µl
    ABI Prism solution version 3.1 ou 1.1
     2 µl
     2 µl
    Amorce à 10 µM   1 µl
     1 µl
     matrice cf tableau sus-cité   cf tableau sus-cité
     H2O qsp 20 µl   qsp 20 µl

    Ne jamais mettre plus de 2 µl de ABI Prism solution

    • Programme utilisé pour une machine GeneAmp 9700 :
    Pour des réactions de séquences à partir de produits PCR et ADN plasmidique :
    96°C 1 min
    96°C 10 sec }
    50°C 5 sec } 25 à 35 cycles
    60°C 4 min }


    Pour des réactions de séquences à partir de matrices Cosmide, fosmide, BAC:
    98°C 2 min
    95°C 20 sec }
    53°C 10 sec } 50 cycles
    60°C 3 min }
    72°C 5 min

    et dans les deux cas :

    15°C for ever
    Conserver la plaque à 4°C ou à -20°C

    2-2 Elimination de l’excès des réactifs de séquençage par précipitation éthanol

    • Ajouter 1µl d'acétate de sodium 3M, 1µl d'EDTA 125mM et 50µl d'éthanol 95 % dans chaque puits.
    • Retourner la plaque plusieurs fois et laisser 15 minutes sur la paillasse.
    • Centrifuger pendant 30 minutes à 3300 rpm à 15°C. -
    • Jeter le surnageant.
    • Centrifuger la plaque à l'envers posée sur du papier absorbant à 1000 rpm pendant 1 minute. (élimination des traces résiduelles d'éthanol).
    • Ajouter 50 µl d'éthanol 70 %.
    • Centrifuger pendant 15 minutes à 3300 rpm à 15 °C.
    • Jeter le surnageant.
    • Centrifuger la plaque à l'envers posée sur du papier absorbant à 1000 rpm pendant 1 minute. (élimination des traces résiduelles d'éthanol).
    • Laisser sécher à l'air libre sur la paillasse 15 minutes.
    • Conserver la plaque à -20°C avant le chargement sur les séquenceurs à capillaires.

    Purification des produits PCR en plaque 96 puits (un exemple de protocole de purification avec Biogel P100)

    1. Réactifs et produits

    • P100 gel fine (Biorad cat. 150-4174)
    • Plaque à fond filtrant 0,45 µm : Multiscreen MAHV N45 (Millipore)
    • Adaptateur (Multiscreen centrifuge frame aqueous Ð MACF09604- Millipore)
    • H2O filtrée type MilliQ Synthesis (Millipore) et autoclavée
    • Plaque 96 puits
    • Centrifugeuse pour plaque (ex : 5810 Eppendorf)

    2. Protocoles

    2-1 Préparation de la solution du Biogel P100

    • Mélanger 50 gr de gel P100 dans un litre d'H2O.
    • Préparer au moins 24 heures à l'avance.
    • Stocker à + 4 °C.

    2-2 Purification

    • Faire le montage suivant : plaque à fond filtrant 0,45 µm + adaptateur + plaque de récupération (poubelle)
    • Déposer 200 µl de gel P100 dans chaque puits de la plaque MAHV N45
    • Centrifuger pendant 3 minutes à 1500 rpm (accélération 3, décélération 0) à température ambiante.
    • Déposer à nouveau 200 µl de gel P100 dans chaque puit de la plaque MAHV N45.
    • Centrifuger pendant 3 minutes à 1500 rpm (accélération 3, décélération 0) à température ambiante.
    • Faire le montage suivant : plaque contenant le gel + adaptateur + plaque 96 puits destinée à recueillir les échantillons purifiés.
    • Déposer au centre de chaque puits, les produits PCR à purifier.
    • Centrifuger pendant 4 minutes à 1500 rpm (accélération 3, décélération 0) à température ambiante.
    • Les produits PCR purifiés sont dans la plaque 96 puits.
    • Conserver la plaque à 4 °C ou à - 20 °C.