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Migration de réaction de séquences déposées en barrettes 8 puits (au 20 juillet 2012)

Les réactions de séquence auront été réalisées en suivant les protocoles décrits ci-dessous.

Démarche à suivre impérativement :

Les barrettes, étiquetées du nom du dépositaire et munies de l’orientation des puits et de la chimie utilisée (BD v3.1 ou v1.1).
Elles seront déposées sur le portoir mis à disposition dans le congélateur -20°C n' 1 - localisé au 3ème étage du Bat. 14A - pièce 05 (le même que celui pour le dépot des plaques 96 puits) et avant midi pour une migration dans la nuit suivante, en fonction des disponibilités du séquenceur.


exemples d’étiquetage


Les réactions de séquence déjà purifiées (par précipitation éthanol ou par filtration sur colonne) seront également acceptées.

Après contrôle des électrophorégrammes par PF1, ceux-ci seront distribués par mail automatiquement vers les demandeurs respectifs.

Le coût de passage d’une barrette de 8 puits sera de 10 €, que la barrette soit complète ou non.
Pour tous renseignements complémentaires, contacter pf1@pasteur.fr

Protocoles recommandés  (au 03 juin 2009)

Réactions de séquence

1. Réactifs et produits

  • ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit version 3.1 (Applied Biosystems réf. 4337456, magasin général réf. 99219 )
  • ou version 1.1 (Applied Biosystems réf. 4337451, magasin général réf. 98150) à stocker à -20 °C
  • Tampon 5X (fourni avec le Kit version 3.1, Applied Biosystems) à stocker à + 4°C
  • Plaque 96 puits (ABgene ref. AB1100, magasin général ref. 42741) ou 4titude Dutscher (Dutscher réf : 044754)
  • H2O filtrée type MilliQ Synthesis (Millipore)
  • Ethanol absolu
  • Acétate de sodium 3M pH 5,2
  • EDTA 125 mM pH 8

Recommandations

  • Il est impératif de mettre les échantillons de A1 à H1 .
  • Vérifier les quantités et la qualité  des matrices par une mesure des absorbances (DO 260, DO 280, DO 230) et par un dépôt et migration sur gel d'agarose

2. Protocoles

2-1 Protocoles pour les réactions de séquence : ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready -version 3.1 ou version 1.1

  • Ces protocoles sont standardisés et peuvent être adaptés au besoin après le résultat d’un premier passage sur le séquenceur:
  • Type de matrice
    Quantité nécessaire
    Produit PCR
    200 -500 bp
    500 - 1000 bp
    1000 - 2000 bp
    > 2000 bp

    8 - 10 ng
    15 - 20 ng
    10 - 40 ng
    30 - 50 ng
    ADN Plasmidique
    de 4.5 à 8 kb
    ± 15 kb

    75-150 ng
    200 à 500 ng


  • Mélange réactionnel pour une réaction de séquence dans un volume final de 10 µl :

  • Réactifs
    Produit PCR 200-500 pb
    Produit PCR 500-1000 pb
    Produit PCR >1000 pb ADN plasmidique
    Amorce à 4 µM
    1 µl
      1 µl 1 µl 
    1 µl 
    ABI Prism solution version 3.1 ou 1.1
    0.5  µl
    0.8 µl   1 µl
    1 µl  
    Tampon 5 X
    2 µl
    2 µl 
     2.5 µl
      2 µl 
    matrice
    cf tableau sus-cité
    cf tableau sus-cité
    cf tableau sus-cité
    cf tableau sus-cité
    H2O
     qsp 10 µl
    qsp 10 µl
    qsp 10 µl
    qsp 10 µl

    Ne jamais mettre plus de 1 µl de ABI Prism solution

    • Programme utilisé pour une machine GeneAmp 9700 :
    Pour des réactions de séquences à partir de produits PCR et ADN plasmidique :
    96°C 1 min
    96°C 10 sec }
    50°C 5 sec } 25 à 35 cycles
    60°C 4 min }


    15°C for ever
    Conserver la plaque à 4°C ou à -20°C

    2-2 Elimination de l’excès des réactifs de séquençage par précipitation éthanol

    • Ajouter 1µl d'acétate de sodium 3M, 1µl d'EDTA 125mM et 50µl d'éthanol 95 % dans chaque puits.
    • Retourner la plaque plusieurs fois et laisser 15 minutes sur la paillasse.
    • Centrifuger pendant 30 minutes à 3300 rpm à 15°C. -
    • Jeter le surnageant.
    • Centrifuger la plaque à l'envers posée sur du papier absorbant à 1000 rpm pendant 1 minute. (élimination des traces résiduelles d'éthanol).
    • Ajouter 50 µl d'éthanol 70 %.
    • Centrifuger pendant 15 minutes à 3300 rpm à 15 °C.
    • Jeter le surnageant.
    • Centrifuger la plaque à l'envers posée sur du papier absorbant à 1000 rpm pendant 1 minute. (élimination des traces résiduelles d'éthanol).
    • Laisser sécher à l'air libre sur la paillasse 15 minutes.
    • Conserver la plaque à -20°C avant le chargement sur les séquenceurs à capillaires.

    Purification des produits PCR  (un exemple de protocole de purification traitement ExoSAP)

    1. Réactifs et produits

    • Exonucléase I (USB)
    • SAP (Shrimp Alkaline Phosphatase) (USB)

    2. Protocole

    • Pour un volume final maximal de 20 µl de produits PCR :
    • - x µl de produit d'amplification (5 à 18 µl)
    • - 1 µl d'exonucléase I à 10 U/µl
    • - 1 µl de SAP (phosphatase alcaline) à 1 U/µl
    • Mélanger au cone
    • Incubation 15 min à 37 C
    • puis Incubation 15 min à 85 C pour la dénaturation des enzymes
    • Stocker à -20 C avant leur utilisation