Recommandations et protocoles


Vous entrez ici dans le monde des techniques histologiques…Souvenez-vous qu’une fois que le tissu est fixé et inclus, on ne peut plus revenir en arrière. Or il existe plusieurs méthodes possibles de fixation et d’inclusion. Toutes ont leurs avantages et leurs inconvénients. Le choix doit se faire en fonction de l’usage ultérieur que l’on veut faire des coupes (coloration simple, immunohistochimie).
 
Il est donc impératif
 
·     de lire les conseils qui suivent avant de prélever vos échantillons,
·     et de nous contacter avant d’effectuer les prélèvements que vous souhaitez nous transmettre.
 
De la qualité des coupes histologiques dépend la qualité des observations et de leur interprétation. Nous sommes à votre disposition pour que le résultat final soit le meilleur possible.
 
 
 
  

Petit guide de l’histologie (à l’usage des débutants)


 
Vous trouverez ci-dessous quelques notions de base très utiles. De nombreuses adresses de sites Web sur les techniques histologiques figurent aussi sur notre site (rubrique Plateau technique, liens utiles).
 
Les tissus destinés à être examinés au microscope optique peuvent être traités suivant deux filières : (1) l’inclusion et la coupe en paraffine ou (2) la congélation et la coupe au cryostat. Le choix du mode de traitement a des conséquences majeures comme le montre le tableau 1.
 
Tableau 1 : Avantages et inconvénients paraffine / congélation
 
 
Coupes paraffine
Coupes congelées
Matériel pour l’inclusion
Automate d’inclusion
Station d’enrobage
Paraffine, alcool, xylène
Azote liquide
isopentane
Matériel pour la coupe
Microtome
Cryostat
Epaisseur des coupes en routine
4-5 um
8-10 um
Morphologie
+++
+
Préservation des antigènes
 
 
Cytoplasmiques
+++
+++
Membranaires
+/-
+++
Mise en évidence des lipides
Non
Oui
Histoenzymologie
Non
Oui
Immunomarquage
 
 
Techniques enzymatiques
Oui
Oui
(PAP, APAAP, ABC)
 
 
Immunofluorescence
Non *
Oui
Marquages par des lectines
Oui
Oui
Hybridation in situ
Oui
Oui
* à nuancer car il est techniquement possible de faire des immunomarquages en fluorescence sur
 des coupes en paraffine.
 
Dans tous les cas, les 4 grandes étapes après le prélèvement de l’échantillon de tissu sont (1) la fixation, (2) l’inclusion, (3) la coupe et (4) le traitement de la coupe selon le type d’information recherché sur la coupe (coloration, immunohistochimie, hybridation in situ).
 
(1) Fixation
But de la fixation
Le but de la fixation est de maintenir les tissus ou les organes prélevés dans un état proche de l’état ante mortem en évitant les conséquences de la privation en oxygène après la mort. La fixation empêche donc à la fois la dégradation du tissu par les enzymes cellulaires libérées au moment de la mort des cellules, et sa putréfaction liée à la prolifération bactérienne. Les fixateurs les plus utilisés (comme le formaldéhyde ou l’acide picrique) ont aussi un effet durcissant.
 
La fixation peut être chimique ou physique par le froid (congélation) pour les coupes congelées.
 
Fixateurs chimiques
Différents fixateurs chimiques existent dont les mécanismes de fixation varient. Le fixateur le plus utilisé est le formaldéhyde. En routine, il est dilué à 4% final à partir d’une solution à 40% diluée au 10ème (et c’est pour cela qu’on l’appelle aussi Formol 10%). Il doit être impérativement tamponné et stabilisé. Le formaldéhyde est très irritant pour la peau, le nez, la gorge, les yeux. Ce produit est aussi responsable d’allergie. L’inhalation de formol peut aussi être à l’origine de cancers du nasopharynx.
Il est donc très fortement recommandé d’utiliser un formol commercial prêt à l’emploi et de le manipuler sous sorbonne.
 
Le paraformaldéhyde est une solution de formol fraîchement préparée. Il est interdit désormais de stocker du paraformaldéhyde sous forme de poudre et par conséquent d’en préparer une solution.
 
Des substituts au formol sont en cours d’évaluation.
 
Le principe chimique de fixation par les aldéhydes comme le formaldéhyde, le paraformaldéhyde, ou le glutaraldéhyde est la formation de pontages intermoléculaires qui stabilise le tissu.
 
Fiches toxicité formol
 
Règles d’Or de la fixation chimique
1.   Fixer le plus vite possible après la mort de l’animal ou le prélèvement
2.   Fixer par perfusion s’il s’agit de prélever l’encéphale ou la mœlle épinière
3.   Mettre au moins 20 fois le volume de fixateur par rapport au volume de l’échantillon
4.   Immerger l’échantillon dans le liquide fixateur
5.   Utiliser des flacons à fond plat (éviter les tubes à fond conique dont l’échantillon risque de prendre la forme...)
6.   Laisser fixer 24h à température ambiante
7.   Rincer dans le PBS puis conserver l’échantillon dans l’alcool à 70° (à température ambiante)
 
Fixation par congélation
 
La fixation initiale pour les coupes en congélation est le froid, mais on post-fixe souvent ces coupes avec de l’acétone, du formaldéhyde ou de l’alcool.
 
Règles d’Or de la congélation d’un tissu en histologie
1.   Fixer le plus vite possible après la mort de l’animal ou le prélèvement.
2.   Enrober l’échantillon avec de l’OCT® dans un moule en plastique identifié.
3.   Plonger rapidement l’ensemble dans l’isopentane refroidi par l’azote liquide.
La congélation est quasiment immédiate.
4.   Mettre ensuite les échantillons congelés, toujours dans leur moule, à -80°C.
 
(2) Inclusion
·     Inclusion en paraffine
L’inclusion consiste à enrober et à infiltrer le tissu dans un milieu assez dur pour être coupé. C’est le rôle de la paraffine dans le processus histologique usuel. L’enrobage en paraffine se fait en deux temps : (1) remplacement de l’eau par la paraffine après déshydratation du tissu par l’alcool, et passage dans le xylène, (2) moulage du bloc. La première étape (ou pré-enrobage) est automatisée, la préparation du bloc est manuelle. C’est une étape critique pour l’orientation finale du tissu dans le bloc et donc sur la coupe.
 
·     Inclusion en congélation
Pour des coupes en congélation, l’OCT est le milieu d’enrobage classique. C’est un gel à température ambiante, qui devient dur en dessous de -10°C.
 
·     Autres types d’inclusion
 
Pour la réalisation de coupes semi-fines (1 um) ou ultrafines (microscopie électronique), on a recours à des résines hydrophobes ou hydrophiles dont la dureté peut être choisie.
 
(3) Coupes
En paraffine, on peut réaliser des coupes d’une épaisseur de 4-5 um sur un microtome.
 
Le cryostat est un microtome placé dans une enceinte réfrigérée qui permet de réaliser des coupes congelées d’une épaisseur 8-10 um en général.
 
(4) Colorations
·     Coloration usuelle
La coloration histologique usuelle est l’hématoxyline-éosine (HE). L’hématoxyline est un colorant nucléaire violet, l’éosine colore le cytoplasme en rouge orangé. On peut y associer le safran qui colore en jaune les fibres conjonctives du tissu interstitiel (HE&S).
 
·     Colorations spéciales
Il existe un très large éventail de colorations dites spéciales, monochromes ou polychromes qui mettent en évidence des constituants particuliers des tissus (mucus, collagène, calcium, fer), ou des éléments étrangers tels que les agents pathogènes.
 
(5) Immunohistochimie
 
Quelques principes de base
L’immunomarquage repose sur l’affinité d’un anticorps spécifique pour l’antigène qu’il reconnaît. Cependant, lorsque l’on travaille sur coupes de tissu, il faut prendre en compte différents paramètres :
 
- les effets de la fixation et du processus histologique. Certains fixateurs comme les aldéhydes provoquent des pontages intermoléculaires à l’origine d’un masquage des épitopes. Il est donc souvent nécessaire de passer par une étape de démasquage (micro-ondes, perméabilisation par des protéases etc.). L’inclusion en paraffine nécessite le traitement du tissu par des solvants organiques (xylène, alcool) et la chaleur (enrobage dans la paraffine liquide à 58-60 °C) dont les effets peuvent aussi être délétères sur les antigènes.
 
- l’accessibilité de l’épitope dans un tissu qui conduit à perméabiliser préalablement le tissu par un traitement protéase.
 
- le niveau d’expression de l’antigène peut être faible. Les techniques d’immunohistochimie utilisent plusieurs couches d’anticorps. L’anticorps primaire est spécifique de l’antigène. L’anticorps secondaire de la deuxième étape est un anti-espèce dirigé contre des déterminants spécifiques de l’espèce dans laquelle l’anticorps primaire a été produit. Il existe différents systèmes d’amplification du marquage (streptavidine-biotine,
 
- l'origine et la nature de l’anticorps primaire. Un anticorps monoclonal se fixe sur un épitope unique alors qu’un anticorps polyclonal peut reconnaître différents épitopes. Un anticorps monoclonal a donc une plus grande spécificité mais une moindre sensibilité qu’un anticorps polyclonal. De plus les anticorps monoclonaux sont généralement préparés chez la souris. Leur utilisation sur des tissus de souris s’accompagne généralement d’un marquage non spécifique (bruit de fond).
 
Pour les raisons évoquées précédemment :
1.   Un anticorps qui donne de bons résultats en Western Blot ne sera pas forcément très performant en immunohistochimie. Les fournisseurs d’anticorps précisent généralement dans leurs fiches techniques si l’anticorps a été testé sur coupes de tissus et dans le meilleur des cas si l’anticorps marche sur tissus fixés par le formol et inclus en paraffine.
 
2.   En règle générale, les immunomarquages notamment de molécules membranaires fonctionnent mieux sur les coupes congelées. Comme déjà évoqué, les qualités morphologiques des coupes congelées sont moins bonnes que celles des coupes en paraffine. L’inclusion en paraffine à bas point de fusion est un bon compromis.
 
3.   Il est plus confortable de disposer d’un anticorps polyclonal car il est plus sensible. De plus, avec ces anticorps produits généralement chez le lapin, ou la chèvre, on ne s’expose pas à un bruit de fond important comme avec l’utilisation d’anticorps monoclonaux de souris.
 
4.   Tout le savoir-faire en immunohistochimie consiste à jongler avec les alternatives et les protocoles pour obtenir le résultat voulu