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Polarisation des lymphocytes T et formation de la synapse immune 
Les lymphocytes T reconnaissent les microorganismes pathogènes sous forme de fragments moléculaires (antigènes) présentés à la surface des cellules présentatrices d’antigène. Suite à la reconnaissance antigénique, le lymphocyte T se polarise vers la cellule présentatrice d’antigène. Cette polarisation se caractérise par des changements de morphologie du lymphocyte T, par la réorientation de son cytosquelette vers la cellule présentatrice d’antigène, et par la concentration de nombreuses molécules à l’interface cellulaire, en particulier le récepteur à l’antigène des lymphocytes T (récepteur T), ainsi que des molécules d’adhésion et de signalisation intracellulaire. Cette jonction cellulaire organisée, formée entre le lymphocyte T et la cellule présentatrice d’antigène, a été appelée “synapse immune” car elle assure la communication complexe qui s’établit entre le lymphocyte T et la cellule présentatrice d’antigène (Figure 1).
 

          
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1. Rôle du cytosquelette d'actine et de microtubules dans la formation de la synapse immune et dans l'activation des lymphocytes T.

R. Lasserre, S. Charrin, C. Cuche, S. Agüera, and A. Alcover


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La reconnaissance d’un antigène par le récepteur T déclenche dans le lymphocyte T des réarrangements importants du cytosquelette d’actine qui conditionnent à leur tour les changements morphologiques et moléculaires observés lors de la formation de la synapse immune (Figure 1 et 2). Cette interdépendance entre l’organisation des molécules membranaires et celle du cytosquelette d’actine nous a conduit à étudier le rôle des protéines ERM (ezrine, radixine, moésine), protéines qui ont la propriété de connecter les composants de la membrane cellulaire au cytosquelette d’actine (Revue, Charrin et al. 2006, Lasserre et al 2010b).
Nous avons montré qu’une de ces protéines, l’ezrine, se polarise vers la synapse immune suite à l’activation du récepteur T (Figure 2A). L’intervention de l’ezrine dans la formation de la synapse immune et dans l’activation du lymphocyte T a été étudiée en exprimant des formes natives ou mutées de cette protéine dans les lymphocytes T, ou par interférence d’ARN. Nous avons montré que la sur-expression d’une forme tronquée de l’ezrine inhibe l’accumulation des récepteurs T à la synapse immune ainsi que l’activation de NF-AT, un facteur de transcription contrôlant l’expression du gène de l’interleukine 2 (IL2) (Roumier et al. 2001, Das et al. 2002). Nos travaux plus récents ont montré un rôle clé de l’ezrine dans la structuration du réseau de microtubules à la synapse immune (Fig 2B) et dans la dynamique des complexes moléculaires de signalisation. De façon intéressante, l’inhibition de l’ezrine résulte en une augmentation des événements précoces d’activation du récepteur T (phosphorylation sur tyrosine de nombreuses protéines et activation de Erk). Par contre, des événements plus tardifs comme l’activation du facteur de transcription NF-AT sont inhibés. Nous avons montré que cette dichotomie d’action de l’ezrine sur les événements précoces et tardifs d’activation était probablement due à l’interaction de l’ezrine avec la protéine régulatrice de la polarité cellulaire Dlg1 (Lasserre et al, 2010a). L’ensemble de ces travaux montrent que les interactions entre le cytosquelette d’actine et le réseau de microtubules, par l’intermédiaire d’ezrine et Dlg1, sont clés pour stabiliser l’architecture de la synapse immune et pour contrôler la transmission du signal d’activation dans les lymphocytes T (Lasserre et al, 2010a,b).
Nous étudions actuellement comment le réseau de partenaires moléculaires interagissant avec l’ezrine qui est impliqué dans la stabilisation du réseau de microtubules à la synapse immune et dans la transmission du signal d’activation du récepteur T. Nous explorons parallèlement les fonctions des microtubules dans la coordination moléculaire nécessaire à l'activation des lymphocytes T.





2. Régulation de l'activation des lymphocytes T par la protéine d'échafaudage SLP-76.

R. Lasserre, C. Cuche and V. Di Bartolo 

 
 
Les signaux intracellulaires générés par l'engagement du récepteur T et de protéines de co-stimulation sont traduits et intégrés par des complexes moléculaires assemblés dans la synapse immunologique. La formation de ces complexes et leur dynamique spatio-temporelle doivent être finement régulé car elles influencent la réponse du lymphocyte T à la stimulation antigénique. Nous essayons de comprendre quels mécanismes contrôlent de façon positive ou négative ces complexes macromoléculaires et quel est leur impact sur les réponses lymphocytaires.
 
Nous nous sommes récemment intéressés à la protéine Hematopoietic Progenitor Kinase 1 (HPK1), l'un des membres de la famille de Serine/Thréonine kinases du Centre Germinatif. Cet enzyme, initialement décrit comme un activateur de la voie des MAP kinases SAPK/JNK, peut agir comme un régulateur négatif de l'activation des lymphocytes T. Des travaux précédents avaient montré que, dans les lymphocytes T activés, HPK1 interagit avec la protéine d'échafaudage SLP76, un acteur clé des voies de signalisation en aval du récepteur T. Cependant, les conséquences fonctionnelles de cet interaction n'étaient pas bien définies. Nous avons montré que HPK1 phosphoryle SLP76 et induit son interaction avec des protéines de la famille 14-3-3. De façon intéressante, cette interaction entraîne une réduction de la signalisation et de l'activation des lymphocytes T (Di Bartolo et al., 2007). Des travaux ultérieurs nous ont permis de montrer que HPK1 contrôle également la phosphorylation de la protéine adaptatrice GADS. Cette protéine est associée de façon permanente à SLP76 et permet le recrutement de ce dernier dans les complexes de signalisation à la synapse immunologique. L'ensemble de nos résultats indique que la phosphorylation simultanée de SLP76 et GADS, induite par HPK1, est nécessaire pour une interaction optimale de ces molécules avec les protéines 14-3-3. Cet interaction résulte en la dissociation du complexe SLP76-GADS des complexes de signalisation, entraînant de cette façon l'extinction des signaux d'activation (Lasserre et al., J.Cell Biol., sous presse).
Nous essayons à présent de comprendre si des stimuli spécifiques ou des situations pathologiques peuvent activer cette boucle de rétrocontrôle négatif dépendante de HPK1 afin de moduler les réponses des lymphocytes T.
 


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3. Rôle du trafic vésiculaire intracellulaire dans la polarisation du récepteur T à la synapse immune. Inhibition par le virus de l'immunodéficience humaine (VIH-1).

H. Soares, M. I. Thoulouze et A. Alcover, en collaboration avec l’Unité Virus et Immunité (O. Schwartz et collaborateurs.) et l’ Imagopole, Institut Pasteur

Pour permettre leur concentration à la synapse immune, les récepteurs T exprimés de façon homogène à la surface de la cellule doivent être acheminés dans la zone de contact avec la cellule présentatrice d’antigène. Différentes formes de transport moléculaire peuvent être impliquées, par des mécanismes de réorganisation des récepteurs T à la surface de la cellule, ou par la mobilisation de compartiments intracellulaires contenant les récepteurs T.
Nous avons montré que les endosomes de recyclage (vésicules par lesquelles transitent les récepteurs membranaires qui sont internalisés et recyclés à nouveau vers la membrane plasmique) peuvent transporter des récepteurs T vers la synapse immune. Par microscopie en temps réel, nous avons montré que les vésicules d’endocytose contenant des récepteurs T se polarisent rapidement vers la zone de contact cellulaire et s’accumulent à la synapse (Figure 4 A). Ce mécanisme n’est pas spécifique du récepteur T, mais implique plus généralement le compartiment d’endocytose et de recyclage (Figure 4 B). Ce compartiment intervient dans le transport d’autres récepteurs, comme le récepteur de la transferrine, et de protéines de signalisation intracellulaire telle la tyrosine kinase Lck. L’importance de ce mode de transport moléculaire sur l’accumulation du récepteur T à la synapse a été établie par microscopie confocale et par analyse d’images quantitative, en utilisant des modulateurs biologiques ou pharmacologiques d’endocytose, de recyclage, de polarisation, ou de fusion de vésicules. Enfin, nous avons montré que des molécules SNARE, qui contrôlent la fusion des vésicules de recyclage à la membrane plasmique, se concentrent à la synapse immune, ce qui indique que cette structure devient une zone active d’accostage et de fusion vésiculaire. L’ensemble de ces données démontre que le transport intracellulaire des vésicules d’endocytose constitue un mécanisme clé pour la polarisation du récepteur T à la synapse immune (Das et al. 2004).

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Le virus de l’immunodéficience humaine du type 1 (VIH-1) détourne de nombreux processus cellulaires pour assurer sa survie et sa multiplication à l’intérieur des cellules infectées, et pour permettre sa propagation à d’autres cellules. Le VIH-1 infecte et se réplique activement dans des lymphocytes T, ce qui conduit à des altérations profondes de la physiologie de ces cellules et à leur déplétion massive dans les individus infectés. L’infection des lymphocytes T par VIH-1 modifie des voies de signalisation intracellulaire, ainsi que l’expression et le trafic intracellulaire de nombreux récepteurs membranaires.
Nous avons étudié les conséquences de l’infection des lymphocytes T par le VIH-1 sur la formation de la synapse immune. Par des approches de microscopie confocale et d’analyse d’image quantitative, nous avons montré que les lymphocytes T infectés par VIH-1 forment des synapses immunes défectueuses: le nombre des conjugués cellulaires est réduit et les synapses qui se forment se caractérisent par une accumulation très réduite du récepteur T et de tyrosine kinase Lck. Cette diminution est due à une altération du trafic intracellulaire de ces molécules, et à leur rétention dans le compartiment endosomial (Figures 5, 6). Enfin, la capacité des lymphocytes T infectés à transmettre des signaux d’activation est alterée, ce qui se traduit par des taux très réduits de protéines phosphorylées à la synapse immune (Thoulouze et al., 2006). Nous avons montré que Nef, une protéine de VIH-1 modulant les phénomènes de trafic et signalisation intracellulaires, est essentiellement responsable de ces altérations. Des modifications de l’endocytose et de la signalisation dans la synapse immune ont probablement des conséquences sur les fonctions et le devenir des lymphocytes T infectées par le VIH-1 (Revues, Alcover & Thoulouze, 2010 ; Fakler et al 2007). Nos objectifs actuels sont de caractériser les compartiments vésiculaires ciblés par le VIH-1 et de déterminer les mécanismes moléculaires responsables de la rétention de Lck et du récepteur T dans des compartiments endosomiaux.


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4. Polarisation des lymphocytes et transmission intercellulaire du virus de la leucémie humaine à cellules T (HTLV-1).

A. M. Pais-Correia, V. Robbiati, R. Lasserre, C. Inizan, A. Alcover et M. I. Thoulouze, en collaboration avec l’Unité d’Epidémiologie et Physiopathologie des Virus Oncogènes (A. Gessain et collaborateurs) et l’Imagopole, Institut Pasteur.

 Les travaux provenant de plusieurs laboratoires indiquent que VIH-1 et HTLV-1 détournent des mécanismes de polarisation impliqués dans la formation de la synapse immune pour se transmettre efficacement d’une cellule à une autre. Il a été décrit que les lymphocytes T infectés se polarisent au contact avec d’autres lymphocytes formant une zone de contact organisée, la « synapse virologique », qui facilite la transmission intercellulaire de ces virus (Revue, Pais-Correia et al. 2007). Nous avons montré récemment que la transmission de HTLV-1 par des synapses virologiques met en jeux des structures extracellulaires complexes, générées par les lymphocytes T infectés, induites par le virus, et similaires aux biofilms bactériens (Fig 7). Ces « biofilms viraux » sont formés des particules virales infectieuses, de protéines de la matrice extracellulaire riches en résidus glycosylés, et de protéines de pontage. Ils sont présents à la surface des cellules T infectées, productrices des virus, et se transmettent à d’autres cellules au cours de contacts cellulaires. L’élimination du biofilm viral de la surface de cellules infectées diminue fortement leur capacité à infecter d’autres cellules (Pais-Correia et al, 2010). Nos objectifs sont à présent de caractériser les mécanismes de production de ces biofilms viraux, de déterminer si d’autres virus forment de telles structures et de caractériser les mécanismes moléculaires qui facilitent la transmissions de ces biofilms d’une cellule à une autre. Pour les virus formant de tels biofilms, il serait intéressant de redessiner des stratégies thérapeutiques anti-virales, qui viseraient non seulement le virus lui-même, mais la formation de ces biofilms viraux (Revues, Thoulouze et Alcover 2010, 2011).
 



Figure 7:
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