Thèmes de recherche

Dynamique du cytosquelette pendant la mobilité et la phagocytose chez E. histolytica.

Nancy Guillén, Elisabeth Labruyère

La mobilité cellulaire repose sur des mécanismes physiques et cellulaires qui engendrent la polarisation de la cellule et orientent son déplacement vers des sources d’attraction telles les molécules inflammatoires. La distribution de complexes protéiques, du cytosquelette ou assurant des fonctions d’adhérence, établit un axe de polarisation antéropostérieur de la cellule, matérialisé par le pseudopode frontal et l’uropode caudal. Notre objectif est de comprendre les mécanismes cellulaires et physiques impliqués dans la formation et la régulation d’un pseudopode persistant qui guide le mouvement aléatoire, puis directionnel de Entamœba histolytica, au sein de tissus humains. Des pseudopodes se forment non seulement au cours de la migration amibienne, mais également pendant la phagocytose des cellules humaines. Les voies de signalisation contrôlant l’activation du cytosquelette lors de la polarisation cellulaire ne sont pas connues. L’efficacité de la migration requiert en plus d’une coordination avec d’autres activités cellulaires, telles que le « capping » des récepteurs (agrégation puis mouvement membranaire rétrograde des récepteurs), le relargage des membranes à l’arrière de la cellule, la dynamique des microtubules et le renouvellement des interactions avec la matrice extracellulaire. Notre projet prend en compte ces différents facteurs influençant la mobilité parasitaire afin d’identifier ceux qui sont engagés dans la formation du pseudopode et dans les voies de signalisation aboutissant à sa persistance lors du mouvement directionnel. 

Film
Au sein des tissus humains, la mobilité dirigée de E. histolytica nécessite que les extensions membranaires latérales soient inhibées et qu’un pseudopode frontal guide le déplacement de l’amibe polarisée. Des facteurs inflammatoires activent la chimiotaxie des amibes. Les molécules d’adhérence, qui doivent s’activer, sont cruciales pour la polarisation de E. histolytica et pour le maintien des forces nécessaires à la propulsion des cellules. La lectine Gal/GalNAc est un complexe protéique assurant l’adhérence. La kinase PAK, les myosines IB et II sont nécessaires à la formation de pseudopodes

Approches expérimentales: imagerie en temps réel, microscopie à deux photons, analyse d’images, microscopie à balayage, cryomicroscopie, modelisation physique, protéomique.

Collaborations: P. Roux (ImagoPole-IP) ; S. Guadagnini et M. Sache (Microscopie Electronique-IP) ; J-C. Olivo (Unité AIQ-IP) ; F Amblard (I. Curie CNRS-UMR168) ; M. Vargas (CINVESTAV, Mexico) ; R. Jain et A. Bhattacharya (Université J. Nehru, India).

Rôle du capping de récepteurs à la surface parasitaire et de l'uropode dans l'amibiase.

Nancy Guillén, Sylvie Syan, Jacques Marquay

Lors du déplacement, les amibes induisent des repliements membranaires localisés à la région caudale où se forme un uropode. Ce dernier concentre les complexes récepteurs-ligands transloqués dans cette région lors du « capping » des récepteurs de surface et est relargué dans le milieu extracellulaire. Les amibes se débarrassent ainsi des ligands qui s’y sont concentrés. La libération dans le milieu extracellulaire des agrégats protéiques et membranaires accumulés dans l’uroïde est un facteur important dans le processus pathogène. Ce mécanisme est essentiel à la survie du parasite car il lui permet d’éliminer des molécules, tels le complément et les immunoglobulines anti-parasitaires. Un des récepteurs de surface de l’amibe subissant le capping est un complexe protéique de 260 kDa : la lectine Gal-GalNAc qui lie le complément et permet ainsi aux amibes de résister à la lyse. La myosine II est essentielle au phénomène de capping de la lectine Gal-GalNAc et la localisation des protéines homologues à l’a-actinine avec ce récepteur dans les agrégats est aussi observée. L’analyse par protéomique de ces agrégats et leur analyse cellulaire pendant l’invasion des tissus devront rendre compte du mécanisme activant le capping et du rôle des particules libérées dans la mise en place de la pathologie et de la réponse inflammatoire. 


Film
Cette séquence en vidéo-microscopie montre le processus de capping des récepteurs induit par l’adjonction de Concanavaline A fluorescente sur Entamoeba histolytica. La Concanavaline A lie de nombreux récepteurs à la surface des amibes, dont le recepteur Gal-GalNAc,. cequi induit leur “capping” et la formation de larges agrégats appelés uroïdes qui sont relargués dans le milieu extérieur.

Approches expérimentales: Analyse par protéomique des amas protéiques, localisation des protéines par microscopie confocale, mise en évidence de leurs effets cytolytiques, cytotoxiques et inflammatoires.

Mobilité et chimiotaxie chez <i>E. histolytica</i> lors de l'amibiase invasive. Réponse inflammatoire.

Elisabeth Labruyère, Samantha Blazquez, Devendra Bansal

La mobilité d’E. histolytica est essentielle aux processus d’invasion et de destruction de la barrière intestinale. Lors de la réaction inflammatoire développée par l’homme, des cytokines et des chimiokines sont sécrétées par les cellules épithéliales, et l’une d’entre elles, le facteur de nécrose tumorale (TNF), est un modulateur clé de l’inflammation. Pour aborder l’étude des mécanismes moléculaires qui contrôlent l’invasion du colon par E. histolytica, nous avons émis l’hypothèse que la chimiotaxie pouvait jouer un rôle en dirigeant E. histolytica vers et/ou à travers les tissus. Récemment, nous avons mis en évidence, in vitro, que le TNF est chimioattractant et chimiocinétique pour E. histolytica. Le TNF n’est pas connu pour être une molécule chimioattractante, mais pour avoir un effet pleiotropique sur les cellules eucaryotes en induisant l’expression de gènes impliqués dans l’activation de cellules de la réaction immunitaire, la survie cellulaire ou l’induction de la mort cellulaire par apoptose.
Ainsi, nous avons décidé d’identifier les voies de signalisation du parasite activées par le TNF et de déterminer si la chimiotaxie d’E. histolytica envers le TNF jouait un rôle dans la physiopathologie de l’amibiase.Pour aborder le premier point, nous avons choisi deux approches différentes : (i) des amibes transfectées et déficientes pour une protéine fixant potentiellement le TNF sont éprouvées pour leur capacité chimiotactique et/ou de viabilité, et (ii) la modulation de l’expression des gènes amibiens en présence de TNF est déterminée à l’aide de biopuces. Afin de répondre au deuxième point, nous avons développé un modèle ex-vivo d’explant de colon humain qui mime les premières étapes de l’invasion de la barrière intestinale par E. histolytica. L’interaction hôte/pathogène et la mobilité du parasite seront analysées à l’aide de la microscopie électronique à balayage, de l’histologie et de l’imagerie en temps réel (3D + temps) ; tandis que la réponse inflammatoire du tissu sera déterminée par des tests quantifiant la viabilité cellulaire et les cytokines sécrétées et par immunohistochimie.


Collaborations: P. Roux et A. Danckaert (Imagerie Dynamique-IP) ;. S. Kerneis (Microscopie Electronique-IP) ; A.-S. Leguern (Centre Médical-IP) ; P. Ave (Unité Histotechnologie-IP) ; C. Zimmer (Unité AIQ-IP). Projet soutenu par le PTR 178 intitulé « Mise au point d’un modèle de colon humain pour l’analyse de l’invasion tissulaire par des pathogènes et pour l’étude de la mobilité cellulaire » et D. Bansal par la bourse Cantarini de l’I. P.
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Destruction de la muqueuse colique par E. histolytica.
Le parasite (e) révélé par un anticorps dirigé contre une protéine de surface envahit la muqueuse d’un explant de colon (coloration à l’hématoxyline) en dégradant le mucus (m), puis en détachant l’épithélium de surface (ep) et celui tapissant les cryptes de Lieberkün (cl).

Réponse du tissu hépatique à l'invasion par <i>Entamoeba histolytica</i>

Caractérisation des changements du taux d’expression génique de cellules endothéliales des sinusoïdes hépatiques en réponse au contact avec le parasite.
Daniela M. Faust, Sylvie Syan

Le foie est composé d’un compartiment parenchymateux (hépatocytes, cholangiocytes, cellules « stellate ») et d’un compartiment non-parenchymateux (cellules de Kupffer, cellules endothéliales). Il est irrigué par les sinusoïdes hépatiques, dans lesquels le flux sanguin est lent, permettant ainsi la résorption efficace de macromolécules et le contact entre les cellules résidant dans les sinusoïdes et les leucocytes passagers. Lors de l’amibiase et après rupture de la barrière intestinale, la dissémination du parasite, par la veine porte, engendre l’abcès hépatique. Dans le foie, les cellules endothéliales des sinusoïdes hépatiques sont parmi les premiers types de cellules à être potentiellement en contact avec le parasite. Avant d’accéder aux hépatocytes, les trophozoïtes doivent traverser la barrière sinusoïdale. Pendant l’invasion lente du parenchyme, les cellules humaines meurent par apoptose et par nécrose. L’abcès hépatique, formé après une mort massive des parasites et une adaptation des trophozoïtes survivants, est caractérisé par une nécrose extensive du tissu. Les régions infectées contiennent des hépatocytes morts et des débris cellulaires, entourés d’un nombre relativement faible de parasites et de cellules inflammatoires infiltrées (polynucléaires neutrophiles et macrophages).
L’objectif principal du projet est d’identifier, par analyse de transcriptomes, les facteurs tissulaires dont le fonctionnement est modifié par l’interaction des cellules hépatiques avec E. histolytica, et particulièrement les facteurs clés impliqués dans la formation des abcès.

Collaborations : A. Cardona et M. Huerre (Unité Histotechnologie-IP) ; B. Regnault, G. Soubigou et J.-Y. Coppée (PF2, Génopole-IP) ; M.-C. Rigothier (Faculté de Pharmacie, Chatenay-Malabry) Soutenu par un financement DARRI (IP).
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Analyse par radio-imagerie de la formation d’abcès hépatiques amibiens. Les micrographies de foies disséqués après 24 h d’infection ont été examinées par un « microimager » et par histologie, permettant l’identification de E. histolytica (immuno-detection), de protéines amibiennes radioactives (précipité d’argent) et des cellules de l’hôte (coloration histologique) (grossissement x1000).

Analyse des fonctions de pathogenèse par biopuces : réponse de Entamoeba histolytica lors de la formation d'abcès hépatiques.

Christian Weber, Julien Santi-Rocca, Fabienne Girard-Misguich

L’abcès hépatique est la complication la plus commune de l’amibiase. Dans un modèle expérimental, nous avons déterminé qu’une étape critique pour la survie d’Entamoeba histolytica survient autour de 12 heures après l’infection. Les facteurs modulés au cours de cette phase du processus invasif permettent à l’amibe de s’adapter à son environnement et d’y survivre ; l’étude de la régulation de l’expression de ces facteurs est cruciale pour comprendre le mécanisme pathogène et proposer des alternatives de thérapie.
Par l’utilisation de biopuces à ADN, nous caractérisons le profil, au cours de l’invasion hépatique, d’expression de gènes potentiellement impliqués dans la pathogenèse. Plusieurs gènes ainsi identifiés comme étant modulés chez les parasites virulents sont étudiés, et leurs produits protéiques analysés par des techniques d’imagerie et de biochimie. L’expression d’un de ces facteurs, KERP1 (protéine riche en lysine et acide glutamique) a été suivie au cours du développement de l’abcès, confirmant son enrichissement. L’utilisation d’une souche entravée dans la production de KERP1 par une stratégie d’ARN antisens a démontré qu’elle est essentielle à la formation d’abcès hépatiques. Le rôle précis de KERP1 au cours de l’infection hépatique est à l’étude par l’analyse des stimuli qui provoquent sa synthèse et des mécanismes de son trafic intracellulaire. 

Approches expérimentales: Biopuces, PCR quantitative en temps réel à l’aide de « molecular beacons », immunocytochimie, immuno-précipation, western blot, imagerie en temps réel par vidéomicroscopie avec un hybride KERP1-green fluorescent protein, ARN antisens.

Collaborations : J.-Y. Coppée, G. Guigon et O. Sismeiro (PF2, Génopole-IP) ; S. Shorte (Imagopole-IP). Projet co-financé par le Conseil Pasteur-Weizmann.
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Analyse immunohistochimique de sections de foyers inflammatoires au sein de foies de hamsters (a) 1 jour, (b) 2 jours, (c) 3 jours et (d) 5 jours après infection. Les noyaux des cellules de l’hôte sont révélés en bleu-mauve. La protéine KERP1 et, par conséquent, les amibes sont marquées en rouge. La protéine KERP1 subit une relocalisation aux régions corticales des trophozoïtes et sa quantité augmente au cours de la formation d’abcès hépatiques dans notre modèle. (Barres = 20µm)

Caractérisation biochimique de protéines impliquées dans la pathogénicité de E. histolytica.

Fabienne Girard- Misguich, Dorota Jeriorowska, Julien Santi-Rocca.

Une analyse par biopuce a permis d’identifier de nouveaux gènes potentiellement impliqués dans la formation d’abcès hépatiques amibiens. Une famille de protéines riches en lysine a ainsi été mise en évidence. Ces protéines riches en lysine (KRiP) n’ont pas de fonction connue. Par microscopie confocale, nous avons montré que ces protéines sont associées à la surface des parasites et une analyse protéomique les a mises en évidence dans les phagosomes, suggérant un rôle de ces protéines dans l’adhésion et/ou la lyse des cellules de l’hôte.
Afin d’étudier le trafic intracellulaire de ces protéines chez E. histolytica, une approche protéomique a été mise en place pour les localiser et identifier leurs partenaires. En utilisant l’électrophorèse en conditions non denaturantes nous étudions les complexes protéiques contenant les protéines KRiP et KERP1. Plusieurs candidats sont en cours d’analyse.

Approches expérimentales: electrophorèse Blue-Native (BN-PAGE), MALDI, LC-MS/MS
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Electrophorèse BN-PAGE de protéines associées en complexe.
Première dimension : Après solubilisation, les différents complexes sont séparés sur un gel BN-PAGE. Après la migration, le gel est excisé en colonne puis soumis à un bain dénaturant afin de dissocier les complexes protéiques.
Seconde dimension : Les protéines de chaque complexe sont séparées électrophorétiquement dans un second gel. Les sous-unités protéiques forment une colonne sur le gel. Les protéines sont alors sélectionnées, éluées du gel et identifiées par spectrométrie de masse.

L'interférence de l'ARN comme une approche génique pour l'étude de la virulence chez Entamoeba histolytica.

Carlos F. Solis, Christian Weber

Entamoeba histolytica est un parasite pour lequel les méthodes de blocage de l’information génétique sont peu développées. Au laboratoire, deux approches différentes ont été éprouvées: (i) la méthode de « soaking », qui utilise des petits ARN double brin (siRNA) spécifiques et complémentaires de la séquence en nucléotides du gène « cible », et (ii) la méthode de « feeding », qui tire parti de la capacité des amibes à phagocyter des bactéries produisant un ARN double brin spécifique d’un gène « cible ». En se basant sur ces deux méthodes, notre équipe vise à généraliser chez E. histolytica la technologie de RNAi comme un outil moléculaire intéressant pour la génomique fonctionnelle du parasite.
Nos données récentes montrent que le RNAi est efficace chez E. histolytica ; nous avons ainsi mis en évidence la diminution de la quantité d’ARNm des tubulines alpha, bêta et de KERP1 chez des amibes cultivées en présence de bactéries produisant l’ARN double brin correspondant à la séquence codant pour chacune de ces protéines. Cette diminution de l’abondance des transcrits ciblés résulte en une réduction de protéine, ce qui a été mis en évidence par immuno-localisation in situ avec des anticorps spécifiques pour les protéines ciblées, ainsi que par analyse par western blot des extraits protéiques d’amibes. Les premiers résultats obtenus montrent que la survie des amibes traitées par RNAi est compromise lorsque l’expression de certains gènes d’intérêt comme ceux codant les tubulines sont inhibés. Actuellement, nous envisageons d’étendre cet aspect de l’extinction génique chez E. histolytica en criblant une banque bactérienne capable de produire des ARN double brin correspondant à des séquences d’ADN complémentaires d’E. histolytica. Le criblage de la banque bactérienne par la méthode de « feeding » sur des amibes en culture visera à identifier des gènes essentiels pour la survie de ce parasite.

Approches expérimentales : ARN interférence par les méthodes de « soaking » et de « feeding », PCR quantitative en temps réel, western blot, biopuces, microscopie confocale.

Collaborations : S. Shorte, M. Nguyen et M.A. Nicola (Imagerie Dynamique-IP) ; C. Bouchier, et E. Dessez (PF1 Génomique-IP). 

Mise au point d'un nouveau test de diagnostic de l'amibiase.

Julien Santi-Rocca, Nancy Guillén

L’amibiase intestinale présente une morbidité très importante, handicapant les 50 millions de personnes atteintes chaque année. En effet, les symptômes sont proches des autres diarrhées hémorragiques et ne permettent pas un diagnostic direct par le praticien, conduisant à la prescription d’antibiothérapies inappropriées et à la persistance du syndrome dysentérique. Cependant, des tests de diagnostic existent mais sont inadaptés aux populations touchées soit par leur coût, soit par leur fiabilité. Nous développons un test de diagnostic de l’amibiase intestinale répondant à quatre impératifs :
- fiabilité : sensibilité et spécificité maximales
- rapidité : résultat obtenu en moins de 10 minutes
- simplicité : réalisable par un utilisateur non-expérimenté
- coût : adapté aux populations vivant en zone d’endémie

Le test reposera sur la technique d’immunochromatographie, déjà employée à l’Institut Pasteur. En pratique, la mise en contact des selles du patient avec une bandelette révèlera par l’apparition (ou l’absence) d’une bande détectable à l’œil nu, l’infection (ou non) par Entamoeba histolytica. L’utilisation d’anticorps monoclonaux spécifiques de facteurs de virulence identifiés dans notre unité permettra de détecter l’espèce pathogène Entamoeba histolytica. Le test sera validé par une étude épidémiologique menée dans le Réseau International des Instituts Pasteur. 

Collaborations : E. Fournié-Amazouz (Unité PMM-IP), F. Nato (PF5-IP) et Y. Germani (Unité PMM-IP). Projet Transversal de Recherche 179 (Institut Pasteur).