Conférence Nobel prononcée le 11 décembre 1965

DE L'ADAPTATION ENZYMATIQUE AUX TRANSITIONS ALLOSTERIQUES

par
JACQUES MONOD
Service de Biochimie de l'Institut Pasteur, Paris

Un jour, il y a presque exactement vingt-cinq ans ­ c'était au début du sombre hiver de 1940 ­ j'entrai dans le bureau d'André Lwoff, à l'Institut Pasteur. Je désirais discuter avec lui d'assez surprenantes observations que j'avais récemment faites.
        Je travaillais alors dans un antique laboratoire de la vieille Sorbonne ouvrant sur une galerie remplie de singes empaillés. Démobilisé au mois d'Août en zone libre, après la débâcle, j'étais parvenu à retrouver ma famille, restée en zone nord, et je m'étais remis au travail avec acharnement. Travail interrompu seulement de temps en temps par la circulation des premiers tracts clandestins. Je voulais achever le plus rapidement possible la thèse de Doctorat que, sous la forte influence biométricienne de Georges Teissier, je consacrais à l'étude de la cinétique de la croissance des populations bactériennes. Ayant déterminé les constantes de croissance en présence de différents glucides, il m'avait paru intéressant de déterminer ces mêmes constantes dans des mélanges de glucides pris deux à deux. Dès la première expérience, je devais observer que si, en présence de certains mélanges, la croissance était cinétiquement normale ­ présentant en particulier une seule phase exponentielle ­ avec d'autres mélanges de sucres on observait deux cycles de croissance complets comportant deux phases exponentielles, séparées par un arrêt complet de la croissance (Fig. 1). Lwoff, après un moment de réflexion à la vue de cet étrange résultat, me dit: "Cela doit avoir quelque chose à voir avec l'adaptation enzymatique". "L'adaptation enzymatique? Connais pas!" lui dis-je. Pour toute réponse, Lwoff me prêta l'ouvrage alors récent de Marjorie Stephenson dans lequel un chapitre résumait, avec beaucoup de discernement, les travaux, peu nombreux encore, concernant ce phénomène, découvert pourtant dès la fin du siècle dernier par Duclaux. Etudié par Dienert et par Went dès 1901, puis par Euler et Josephson, il devait être en quelque sorte redécouvert par Karström qui eut le mérite, en lui donnant un nom, d'attirer l'attention sur son existence. Marjorie Stephenson elle-même et ses élèves Yudkin et Gale devaient y consacrer plusieurs publications avant 1940 (Les références aux travaux antérieurs à 1940 se trouvent dans ( 1 ) ) .           L'intuition de Lwoff était exacte. Le phénomène de "diauxie" que j'avais découvert, était en effet intimement lié à l'adaptation enzymatique, comme je devais rapidement m'en convaincre par des expériences appropriées qui trouvèrent leur place dans la deuxième partie de mon mémoire de Doctorat.

Fig.1.
Croissance d 'Escherichia coli en présence de différents couples de glucides utilisés comme seule source de carbone dans un milieu synthétique (64).

Il s'agissait en fait d'une manifestation de l' "effet glucose" découvert par Dienert dès 1900, plus connu aujourd'hui sous le nom de "répression catabolique" à la suite des travaux de Magtasanik ( 2 ).
          Le sort en était jeté. Depuis ce jour de Décembre 1940, toute mon activité scientifique a été consacrée à l'étude de ce phénomène. Pendant l'occupation, travaillant en partie clandestinement dans le laboratoire de Lwoff qui m'accueillait généreusement, je parvenais à faire quelques expériences, pour moi très significatives. Je vérifiais par exemple que les agents découplant les phosphorylations oxydatives tels que le 2-4-dinitrophénol, inhibaient totalement l'adaptation au lactose ou à d'autres glucides ( 3 ) . Ce qui suggérait que "l'adaptation" impliquait une dépense de potentiel chimique et comportait sans doute une véritable synthèse d'enzyme. Avec Alice Audureau, je m'appliquais à discerner les relations tout à fait obscures encore, entre ce phénomène et celui qu'avaient reconnu Massini, Lewis et d'autres (cf.(1)): l'apparition et la sélection de mutants spontanés. Utilisant une souche d'Escherichia coli mutabile (à laquelle nous avions donné le sigle ML parce que cette souche avait été isolée du tube digestif d'André Lwoff), nous montrions qu'une mutation apparemment spontanée permettait à ces bactéries primitivement "Lactose-négatives" de devenir "Lactose-positives". Cependant nous constations que la souche originale (Lac-) et la souche mutante (Lac+) ne différaient pas l'une de l'autre par la présence de l'équipement enzymatique spécifique, mais bien par la capacité de produire cet équipement enzymatique en présence de lactose. La mutation, en d'autres termes, affectait une propriété génétique virtuelle qui n'était révélée qu'en présence de lactose (4).
          Rien de plus simple, et rien de nouveau: les généticiens savent depuis longtemps que certains génotypes ne s'expriment pas en toutes circonstances.
Mais il s'agissait d'un génotype gouvernant électivement un enzyme, et ses conditions d'expression paraissaient directement liées à l'activité chimique du système. Cette relation me fascinait. Depuis longtemps déjà, influencé par mon amitié et mon admiration pour Louis Rapkine, à qui je faisais de fréquentes et longues visites dans son laboratoire, j'étais tenté, encore que j'y fusse mal préparé, par l'étude des mécanismes biochimiques élémentaires, par l'enzymologie. Mais, sous l'influence d'un autre ami que j'admirais, Boris Ephrussi, j'étais également tenté par la génétique. Grâce à lui et à la Fondation Rockefeller, j'avais eu l'occasion, quelques années auparavant, de faire un séjour d'un an dans le laboratoire de Morgan, au California Institute of Technology. Ce fut pour moi une révélation. Révélation de la génétique, alors presqu'ignorée en France; révélation de ce que peut être un groupe d'hommes de science en pleine activité créatrice, lorqu'il associe dans un constant échange d'idées, de spéculations hardies, de critiques serrées, des personnalités de haute stature telles que George Beadle, Sterling Emerson, Bridges, Sturtevant, Jack Schultz, Ephrussi, qui tous alors travaillaient dans le département de Morgan. Revenu en France, j'avais repris l'étude de la croissance bactérienne. Je demeurais cependant imprégné des concepts de la génétique, confiant dans son pouvoir d'analyse et convaincu qu'un jour ou l'autre, ces notions s'appliqueraient aux bactéries.
          Vers la fin de la guerre, étant encore aux armées, je découvrais dans une bibliothèque ambulante de l'armée américaine quelques livraisons dépareillées de "Genetics" qui contenaient l'admirable mémoire de Luria et Delbrück (5) où ils démontraient, pour la première fois de façon rigoureuse, le caractère spontané de certains mutants bactériens. Je crois bien n'avoir jamais lu un article scientifique avec autant d'enthousiasme: pour moi, la génétique bactérienne était fondée. Quelques mois plus tard, je "découvrais" aussi le mémoire d'Avery, Mc Leod et McCarthy (6): autre révélation fondamentale. Désormais je lisais avidement les premières publications de "l'église" du phage et, lorsqu'en 1945, j'entrais à l'Institut Pasteur dans le service de Lwoff, j'étais tenté d'abandonner l'adaptation enzymatique pour adhérer à l'église et travailler sur le bactériophage. En 1946, j'assistais au mémorable symposium de Cold Spring Harbor où Delbruck et Bailey, et Hershey révélaient leur découverte de la recombinaison chez les virus, tandis que Lederberg et Tatum annonçaient celle de la sexualité bactérienne (7). En 1947, j'étais invité au "Growth Symposium" à présenter un rapport d'ensemble sur l'adaptation enzymatique, qui commençait à éveiller l'attention des embryologistes aussi bien que des généticiens. La rédaction de ce rapport (1) devait être, pour moi, décisive. Revoyant toute la littérature, y compris la mienne, je comprenais plus clairement que ce remarquable phénomène demeurait presqu'entièrement mystérieux, pour ne pas dire inconnu. Mais d'autre part, par sa régularité et sa spécificité, par l'interaction au niveau moléculaire dont il témoignait entre un déterminisme génétique et un déterminisme chimique, il apparaissait d'un tel intérêt, d'une signification si profonde, qu'il ne pouvait plus être question pour moi de ne pas poursuivre. Mais je voyais aussi qu'il fallait faire table rase et tout reprendre à la base.

Fig.2.
Biosynthèse induite de la ß-galactosidase chez Escherichia coli. L'accroissement d'activité enzymatique est exprimé non pas en fonction du temps, mais en fonction de l'accroissement concomittant de protéines bactériennes. La pente de la droite obtenue (P) définit le taux différentiel de synthèse (13).

          Le problème central qui se posait était celui du rôle respectif du substrat inducteur et du ou des gènes spécifiques dans la formation et la structure de l'enzyme. Pour comprendre comment on pouvait envisager ce problème vers 1946, il est bon peut-être de rappeler qu'à cette époque on ne connaissait pas la structure de l'ADN, qu'on savait peu de chose sur celle des protéines et rien sur leur biosynthèse. Il fallait avant tout résoudre la question suivante: l'effet inducteur déclenche-t-il la synthèse totale à partir de ses éléments d'une molécule de protéine nouvelle ou bien s'agit-il de l'activation, de la conversion, du "remodelage" d'un ou plusieurs précurseurs?
          Cela exigeait d'abord que fussent choisis et soigneusement définis les systèmes à étudier. Avec Madeleine Jolit et Anne-Marie Torriani, nous isolions la ß-galactosidase, puis l'amylomaltase d'Escherichia coli (8) (9) (10). Notre groupe s'enrichissait bientôt d'une acquisition précieuse, Melvin Cohn qui, excellent immunologiste, connaissait bien mieux que moi la chimie des protéines ( Il savait par exemple manier un prestigieux appareil qui m' intimidait: le "Tiselius") (11). Avec Anne-Marie Torriani, il caractérisait la ß-galactosidase en tant qu'antigène (12). Connaissant bien le système, nous pouvions maintenant en étudier avec précision la cinétique de formation. Une étude détaillée de cette cinétique entreprise avec Alvin Pappenheimer et Germaine Cohen-Bazire (13) suggérait très fortement que l'effet inducteur du substrat entraînait une biosynthèse totale de la protéine à partir des acides aminés (Fig. 2). Cette interprétation pouvait paraître assez surprenante à cette époque encore, mais elle entraînait d'emblée, je dois le dire, ma conviction. Il y a pourtant, en science, une assez longue distance entre la conviction et la certitude. Mais aurait-on jamais la patience d'attendre et d'établir la certitude, n'était la conviction intime déjà acquise?
          La certitude, nous devions l'obtenir un peu plus tard, grâce à des expériences de marquage isotopique effectuées par Hogness, Cohn et moi-même (14) (15). A vrai dire, les résultats de ces expériences de marquage étaient plus surprenants encore au regard des idées alors courantes sur la biosynthèse des protéines et leur état dans la cellule. Les travaux de Schoenheimer (16) avaient en effet persuadé la majorité des biochimistes que, dans l'organisme, les protéines sont, de façon inhérente dans un "état dynamique", chaque molécule se détruisant et se reconstruisant sur elle-même, perpétuellement, par échange de résidus d'amino-acides. Or l'expérience démontrait au contraire que la molécule de ß-galactosidase était entièrement stable in vivo comme l'étaient également, dans des conditions de croissance normale, les autres protéines de la bactérie. Nos expériences ne contredisaient pas, bien entendu, les résultats de Schoenheimer, mais sapaient très sérieusement leur interprétation selon le dogme de l' "état dynamique".
          Quoiqu'il en soit, ces conclusions, pour nous, étaient précieuses. Nous savions désormais que l' "adaptation enzymatique" correspondait en fait à la biosynthèse totale d'une molécule stable et que, par conséquent, I'accroissement de l'activité enzymatique au cours de l'induction était une mesure authentique de la synthèse de la protéine spécifique.
          L'étude du déterminisme de cette synthèse prenait alors toute sa signification en même temps qu'il devenait plus accessible à l'expérience. Avec Germaine Cohen-Bazire et Melvin Cohn (17) (18), nous pouvions reprendre de façon systématique une question que j'avais abordée déjà à plusieurs reprises: celle des relations entre la spécificité d'action d'un enzyme inductible et la spécificité de l'induction. Les belles observations de Pollock sur l'induction de la Pénicillinase par la Pénicilline obligeaient d'ailleurs également à poser ce problème de façon nouvelle (19). L'étude d'un grand nombre de galactosides ou de dérivés, la comparaison de leurs propriétés en tant qu'inducteurs, substrats ou antagonistes du substrat de l'enzyme, nous conduisaient à la conclusion, une fois de plus assez surprenante, que le pouvoir inducteur n'était nullement le privilège des substrats de l'enzyme ni même des corps capables de former avec lui les complexes les plus stables. Certains thiogalactosides par exemple, non hydrolysés par l'enzyme, ni utilisés métaboliquement, s'avéraient être de très puissants inducteurs. Certains substrats en revanche n'étaient pas inducteurs. La conclusion s'imposait que l'inducteur n'agissait pas ­ comme on l'avait le plus souvent supposé ­ en tant que substrat, ou par combinaison avec quelques molécules d'enzyme actif préformé, mais bien au niveau d'un autre constituant cellulaire spécifique qu'il s'agirait un jour d'identifier (Fig. 3).
          Au cours de ce travail, nous observâmes un fait qui nous parut très significatif: un certain corps, le phényl-ß-D-thiogalactoside, dépourvu de pouvoir inducteur, se montrait capable d'antagoniser l'action d'un inducteur efficace tel que le méthyl-ß-D-thiogalactoside. Cela suggérait la possibilité d'utiliser

Fig.3.
Comparaison de différents ß-galactosides comme substrats et comme inducteurs de la ß-galactosidase.
I. Lactose: substrat de l'enzyme, mais dépourvu d'activité inductrice.
II. Méthyl-ß-D-galactoside: substrat de faible affinité; inducteur efficace.
III. Méthyl-ß-D-thiogalactoside: non hydrolysable par l'enzyme, mais puissant inducteur.
IV. Phényl-ß-galactoside: excellent substrat de l'enzyme; haute affinité; pas d'activité inductrice .
V. Phényl-ß-D-thiogalactoside: pas d'activité comme substrat ni comme inducteur, mais doué d'activité comme antagoniste des inducteurs.

de tels effets d' "antiinduction" pour tenter de vérifier une théorie qu'assez ambitieusement nous appellions l' "induction généralisée". Dès le début de mes recherches, j'avais été préoccupé par le problème que posait l'existence, à côté d'enzymes inductibles, de systèmes "constitutifs", c'est-à-dire (selon la définition alors admise) synthétisés en l'absence de tout substrat ou inducteur exogène. Ce qui est le cas, bien entendu, de tous les enzymes du métabolisme intermédiaire et biosynthétique. Il ne paraissait pas déraisonnable de supposer que la synthèse de ces enzymes fut gouvernée par leur substrat endogène, ce qui eut impliqué que le mécanisme de l'induction fut en réalité universel. Nous étions encouragés dans cette hypothèse par les belles recherches de Roger Stanier sur l'induction, supposée séquentielle, des systèmes qui dégradent les composés phénoliques chez Pseudomonas.
          Je cherchais donc, avec Germaine Cohen-Bazire, à vérifier que la biosynthèse d'un enzyme typiquement "constitutif" (selon les conceptions de cette époque), la tryptophane synthétase, pourrait être inhibée par un analogue du substrat présumé. Comme analogue du substrat, le produit de la réaction paraissait un bon candidat et nous pouvions bientôt constater que le tryptophane et le 5-méthyltryptophane étaient de puissants inhibiteurs de la biosynthèse de l'enzyme. C'était le premier exemple connu de système "répressible" découvert, on le voit, comme vérification d'une hypothèse fausse (20) (21) .
          Je n'avais pas, il faut le dire, une entière confiance dans l'ambitieuse théorie de l'induction "généralisée", qui se heurtait bientôt à diverses difficultés. J'y étais cependant encouragé par une intéressante observation de Vogel et Davis (22) concernant un autre enzyme de biosynthèse, l'acétyl-ornithinase, intervenant dans la formation de l'arginine. Utilisant un mutant exigeant l'arginine ou la N-acétyl-ornithine, ces auteurs avaient constaté que, cultivées en présence d'arginine, les bactéries ne produisaient pas d'acétyl-ornithinase alors que cultivées en présence d'N-acétyl-ornithinase, l'enzyme était synthétisé. D'où leur conclusion que cet enzyme devait être induit par son substrat, la N-acétyl-ornithine. Henri Vogel étant de passage à Paris, j'attirai son attention sur le fait que leurs très intéressantes observations pouvaient également s'expliquer comme résultant d'un effet inhibiteur de l'arginine plutôt que d'un effet inducteur de l'acétyl-ornithine. Pour répondre à cette question, il fallait étudier la biosynthèse de l'enzyme dans un mélange des deux métabolites. L'expérience effectuée prouva qu'il s'agissait effectivement d'un effet inhibiteur et non d'un effet inducteur. Vogel, avec raison, proposait, pour désigner cet effet, le terme de "répression" et donnait ainsi droit de cité aux systèmes "répressibles" à côté des systèmes "inductibles". Par la suite, grâce en particulier aux travaux de Maas, Gorini, Pardee, Magasanik, Cohen, Ames et de beaucoup d'autres (cf. réf. in (23) ), le domaine des systèmes répressibles s'étendit considérablement: on sait aujourd'hui que pratiquement tous les systèmes biosynthétiques bactériens sont gouvernés par de tels mécanismes.
          Cependant, je restais pour ma part fidèle à la ß-galactosidase d'Escherichia coli, sachant bien que nous étions loin d'avoir épuisé les ressources de ce système. Au cours des années passées à établir la nature biochimique du phénomène, je n'avais pu que très partiellement aborder la question de son déterminisme génétique. Suffisamment pourtant pour me convaincre que celui-ci était d'une extrême spécificité et justifiait l'idée que le postulat de Beadle et Tatum "un gène-un enzyme" s'appliquait aux enzymes inductibles et dégradatifs tout aussi bien qu'aux enzymes de biosynthèse qu'avait principalement étudiés l'école de Stanford. Ces conclusions m'avaient conduit à abandonner une idée adoptée à l'origine comme hypothèse de travail, à savoir que plusieurs enzymes inductibles différents pourraient résulter de la "conversion" d'un précurseur unique dont la synthèse aurait été gouvernée par un seul gène, hypothèse d'ailleurs contredite également par les résultats de nos expériences de marquage.
          Mais l'analyse génétique se heurtait encore à de graves difficultés: tout d'abord, la fréquence des recombinaisons avec les systèmes de conjugaison dont on disposait jusqu'alors, était trop faible pour qu'une analyse génétique fine puisse être entreprise. Une autre difficulté nous arrêtait qui était l'existence de phénotypes mystérieux; certains mutants (appelés "cryptiques" incapables

Fig. 4.
Mise en évidence de la galactoside-perméase.
          En haut: accumulation de méthyl-ß-D-thiogalactoside radioactif par une suspension de bactéries préalablement induites. Déplacement du galactoside accumulé par un autre galactoside (phényl-ß-D-thiogalactoside).
          En bas: accumulation d'un galactoside chez des bactéries préalablement induites en fonction de la concentration du galactoside externe. Coordonnées inverses: les constantes K et Y définissent respectivement la constante de dissociation apparente et l'activité apparente du système d'accumulation (25).

de métaboliser les galactosides s'avéraient pourtant capables de synthétiser la ß-galactosidase. La solution de ce problème devait nous être apportée par hasard, quand nous cherchions tout autre chose. En 1954, alors que la direction du nouveau service de Biochimie Cellulaire venait de m'être confiée, Georges Cohen se joignait à nous et je lui proposais ainsi qu'à Howard Rickenberg, d'utiliser les propriétés d'inducteur "gratuit" des thiogalactosides pour tâcher d'étudier leur devenir chez les bactéries inductibles, ceci en utilisant un thiogalactoside marqué au carbone 14. Dès la première expérience, nous constations que la radioactivité associée au galactoside s'accumulait rapidement dans les bactéries induites de type sauvage, mais non pas chez les mutants dits cryptiques. La radioactivité ne s'accumulait pas non plus chez les bactéries de type sauvage non préalablement induites: la capacité d'accumulation dépendait donc d'un facteur inductible. L'étude de la cinétique, de la spécificité d'action, de la spécificité d'induction de ce système ainsi que la comparaison de différents mutants nous conduisaient à la conclusion que l'élément responsable de cette accumulation ne pouvait être qu'une protéine spécifique, dont la synthèse gouvernée par un gène (y) distinct de celui de la galactosidase (z) était induite par les galactosides en même temps que celle de l'enzyme. A cette protéine, nous donnions le nom de "galactoside-perméase" (24) (25) ( 26) (Fig. 4) .
          L'existence même d'une protéine spécifique, responsable de la perméation et de l'accumulation des galactosides, a pu être mise en doute parfois du fait que sa définition reposait exclusivement sur des observations in vivo. Certains, qui ne doutaient pas sérieusement de l'existence de cette protéine, m'ont parfois aussi reproché de lui avoir donné un nom alors qu'elle n'était pas isolée. Cette attitude me fait penser à celle de deux gentlemen britanniques traditionnels qui, si même ils se connaissent fort bien de nom et de réputation, ne sauraient en aucune facon s'adresser la parole avant d'avoir été formellement présentés l'un à l'autre. Pour ma part, je n'ai jamais douté un instant de l'existence de cette protéine, l'ensemble de nos résultats ne pouvant pas s'interpréter d'autre façon. N'empêche que j'ai été fort heureux d'apprendre tout récemment que, grâce à une très belle expérimentation, Kennedy était parvenu à identifier in vitro et à isoler la protéine inductible spécifique de la galactoside-perméase (27). Kennedy a brillamment réussi là où nous avons échoué car, à plusieurs reprises nous avions cherché à isoler in vitro la galactoside-perméase. Ces efforts pourtant n'ont pas été infructueux, puisqu'ils nous ont conduit, avec Irving Zabin et Adam Kepes, à isoler une autre protéine, la galactoside-transacétylase (28) (29). Pendant quelques semaines, nous avons pu croire que cet enzyme n'était autre que la perméase elle-même. C'était une fausse piste, et aujourd'hui encore on ignore totalement la fonction physiologique de cette protéine. Trouvaille fructueuse néanmoins, car la transacétylase, déterminée par un gène appartenant à l'opéron lactose a été, par la suite, très utile aux expérimentateurs, sinon à la bactérie elle-même.
          L'étude de la galactoside-perméase devait révéler un autre fait de grande signification. Nous avions, quelques années auparavant, après Lederberg, isolé des mutants "constitutifs" pour la ß-galactosidase, c'est-à-dire des souches chez lesquelles l'enzyme était synthétisé en l'absence de tout galactoside. Or nous constations maintenant que la mutation constitutive avait un effet pléiotrope. Chez ces mutants, en effet, la galactoside-perméase aussi bien que la galactosidase (et la transacétylase) étaient simultanément constitutives, alors que nous savions par ailleurs que chacune des trois protéines était gouvernée par un gène distinct. Il fallait donc admettre que la mutation constitutive, encore que très fortement liée aux loci gouvernant la galactosidase, la galactoside-perméase et la transacétylase, intervenait dans un gène (i) distinct des trois autres (z, y et Ac) et dont les relations avec les trois protéines violaient le postulat de Beadle et Tatum.
          Mais il convient ici de replacer ces recherches, et l'orientation que nous voulions désormais leur donner, dans la perspective nouvelle qui s'offrait à la biologie vers 1955. C'est en 1953 que Watson et Crick proposaient, en se fondant sur les observations de Chargaff et de Wilkins, leur modèle de la structure de l'ADN. D'emblée, dans cette double séquence complémentaire, on pouvait "lire" I'interprétation du mécanisme de la réplication identique du matériel génétique. Un an auparavant cependant, Sanger avait décrit la séquence peptidique intégrale de l'insuline, tandis qu'on savait déjà, par les travaux de Pauling et Itano (30) en particulier, qu'une mutation génétique peut entraîner une modification limitée de la structure d'une protéine. En 1954, Crick et Watson (31) et Gamow (32) proposaient la théorie du code génétique: la structure primaire des protéines est déterminée, définie, par la séquence linéaire des nucléotides dans l'ADN. Ainsi la profonde intuition logique de Watson et Crick leur avait-elle permis de découvrir une structure qui d'emblée rendait compte, au moins en principe, des deux fonctions essentielles depuis longtemps assignées par les généticiens au matériel héréditaire: gouverner sa propre synthèse, commander celle des constituants non génétiques. La Biologie moléculaire était née et je m'apercevais que moi aussi je faisais depuis longtemps, sans le savoir, à la manière de Monsieur Jourdain, de la Biologie Moléculaire.
          Il y a plus de dix ans de cela, et les idées dont je rappelle ici l'éclosion étaient loin alors de trouver une audience uniformément enthousiaste. Ma conviction pourtant était faite longtemps avant que l'absolue certitude ne fut acquise. Elle l'est aujourd'hui grâce à la succession de découvertes, quelques-unes presqu'inespérées, qui sont venues enrichir notre discipline depuis cette époque. C'est dans cette perspective, qui chaque année s'approfondissait, que les recherches que je vais maintenant rappeler ont pu s'orienter et se développer.
          Une fois comprises les relations physiologiques de la galactosidase et de la galactoside-perméase, et démontré le fait qu'elles dépendaient de deux éléments génétiques distincts tout en demeurant soumises au même déterminisme d'induction comme aux mêmes mutations constitutives, il devenait indispensable d'analyser les structures génétiques correspondantes. On devait en particulier chercher à étudier en détail l'expression de ces gènes, ainsi que les relations de dominance entre leurs allèles.
          Or à cette époque justement, les travaux de Jacob et Wollman (33) avaient élucidé le mécanisme de la conjugaison bactérienne; on savait que celle-ci consiste en l'injection, sans fusion cytoplasmique, du chromosome d'une bactérie mâle à une femelle. On pouvait même suivre la cinétique de pénétration d'un gène donné. Nous décidions, avec Arthur Pardee et François Jacob, d'utiliser ces armes expérimentales nouvelles pour suivre l'"expression" des gènes z et i injectés dans une femelle portant des allèles mutants de ces gènes.
          Cette expérience difficile, menée à bien grâce au talent expérimental d'Arthur Pardee, devait livrer deux résultats remarquables et, en partie au moins, inattendus. Tout d'abord le fait que le gène z (que nous savions être le déterminant de structure) s'exprimait (par la synthèse de ß-galactosidase) avec une extrême rapidité, et d'emblée au taux maximum. Je passerai sur le développement et les conséquences de cette observation qui fut l'une des sources de la théorie du messager. En second lieu, I'allèle inductible du gène i était dominant sur l'allèle constitutif, mais cette dominance ne s'exprimait qu'assez lentement. Tout se passait comme si ce gène était responsable de la synthèse d'un produit qui inhibait, réprimait, la biosynthèse de l'enzyme. D'où le nom de "répresseur" donné au produit de ce gène et l'hypothèse que l'inducteur agissait, non pas en provoquant la synthèse de l'enzyme mais en "inhibant un inhibiteur" de cette synthèse (34) (35) (36).
          Certes j'avais appris, comme chacun, à l'école, que deux négations valent une affirmation et nous avions, avec Melvin Cohn, discuté, sans trop la prendre au sérieux, cette possibilité logique que nous appelions la "théorie du double bluff", songeant à la subtile analyse du jeu de poker par Edgar Poe.
          Je vois cependant aujourd'hui plus clairement que jamais combien j'ai été aveugle en ne prenant pas plus tôt au sérieux cette hypothèse alors que, plusieurs années auparavant, nous avions découvert l'inhibition par le tryptophane de la synthèse de la tryptophane-synthétase et que les travaux ultérieurs de Vogel, de Gorini et Maas et d'autres (loc. cit.) avaient démontré que la répression n'était pas due, comme nous avions pu le croire, à un effet d'antiinduction. J'avais toujours espéré que la régulation des systèmes "constitutifs" et celle des systèmes inductibles pourrait un jour s'expliquer par un même mécanisme. Pourquoi alors, puisque l'existence de systèmes répressibles et leur extrême généralité étaient maintenant démontrées, ne pas supposer que l'induction pourrait résulter d'un effet anti-répresseur plutôt que la répression d'un effet antiinducteur? C'est précisément la thèse que Leo Szilard, de passage à Paris, vint nous proposer au cours d'un séminaire, alors que nous venions seulement de dépouiller les premiers résultats de l'expérience d'injection, sur l'interprétation desquels nous hésitions encore. Nos observations préliminaires confirmaient la pénétrante intuition de Szilard et, dès la fin de son exposé, mes scrupules à l'égard de la "théorie du double bluff" étaient levés, ma conviction faite. Une fois de plus, longtemps avant que je ne puisse l'égaler à une certitude.
          Certains des plus importants développements de ce travail: la découverte des mutants opérateurs et de l'opéron en tant qu'unité d'expression coordonnée du matériel génétique, les bases et la démonstration de la théorie du messager sont exposées par François Jacob dans sa conférence et je ne m'y arrêterai pas pour en revenir à ce constituant, le répresseur, dont l'existence et le rôle m'avaient échappé si longtemps. A vrai dire, je me trouve maintenant encore quelques excuses. Il n'était pas aisé de se dégager totalement de l'idée toute naturelle qu'il devait exister entre l'inducteur d'un enzyme et l'enzyme lui-même une relation de structure nécessaire, inhérente au mécanisme du phénomène. Et je dois avouer que, jusqu'en 1957, j'avais essayé de "sauver" cette hypothèse, quitte à réduire à rien le rôle "didactique", comme dirait Lederberg, de l'inducteur.
          Désormais il fallait y renoncer totalement. Une expérience réalisée avec David Perrin et François Jacob démontrait d'ailleurs que le mécanisme de l'induction fonctionnait parfaitement chez certains mutants produisant une galactosidase modifiée totalement dépourvue d'affinité pour les galactosides (37) .
          Ce qu'il s'agissait maintenant d'analyser et de comprendre, c'était les interactions du répresseur avec l'inducteur d'une part, avec l'opérateur de l'autre. Otto Warburg a dit une fois, paraît-il, parlant de la cytochrome oxydase, que cette protéine ­ ou présumée telle ­ était aussi inaccessible que la matière des étoiles. Que dire alors du répresseur connu seulement par les conséquences de ses interactions? Nous sommes, à cet égard, un peu dans la situation d'un inspecteur de police qui, trouvant un cadavre avec un poignard dans le dos, en déduit qu'il doit exister quelque part un assassin; mais quant à savoir qui est l'assassin, comment il se nomme, s'il est grand ou petit, brun ou blond, c'est une autre affaire! La police, dans ce cas, parvient paraît-il quelquefois à des résultats en traçant, d'après quelques indices, un "portrait-robot" du coupable. C'est ce que je vais essayer de faire maintenant en ce qui concerne le répresseur.
          Tout d'abord, il faut assigner à l'assassin ­ je veux dire au répresseur ­ deux propriétés: celle de reconnaître l'inducteur et celle de reconnaître l'opérateur, reconnaissance nécessairement stérique, donc susceptible d'être modifiée ou abolie par mutation. La perte du pouvoir de reconnaître l'opérateur aurait pour conséquence la dérépression totale du système. Toute mutation entraînant une dislocation de la structure du répresseur ou l'abolition de sa synthèse doit donc apparaître comme "constitutive" et cela explique sans doute la fréquence relativement élevée de ce type de mutations.
          On peut envisager cependant, si le portrait-robot est exact, que certaines mutations puissent abolir la reconnaissance de l'inducteur tout en respectant celle de l'opérateur. De telles mutations auraient un phénotype très particulier. Elles seraient non inductibles (c'est-à-dire lactose-négatives) et en outre elles seraient dominantes en cis comme en trans dans les diploïdes. Nous avons pu, avec Clyde Willson, David Perrin et Melvin Cohn ( 38 ), isoler deux mutants possédant précisément ces propriétés et une vingtaine d'autres ont été récemment isolés par Suzanne Bourgeois (39).
          En traçant ce début de portrait-robot, j'ai implicitement supposé qu'il y avait un seul assassin et non pas deux, c'est-à-dire que les propriétés du système s'expliquent par l'intervention d'une seule espèce moléculaire, le répresseur, produit du gène i. Cette hypothèse n'est pas a priori obligatoire. On pourrait par exemple supposer que la reconnaissance de l'inducteur est due à un constituant distinct de celui qui reconnaît l'opérateur. Encore faudrait-il admettre alors que ces deux constituants peuvent se reconnaître mutuellement. Cette hypothèse paraît aujourd'hui à peu près exclue par des expériences de Bourgeois, Cohn et Orgel (39) qui démontrent, entre autres résultats importants, que les mutations de type i- (portant sur la reconnaissance de l'opérateur) et les mutations de type i8 (portant sur la reconnaissance de l'inducteur) interviennent dans un même cistron et portent donc, selon toute apparence, sur la même molécule, produit unique du gène régulateur i.
          Une question essentielle est la nature chimique du répresseur. Dans la mesure où celui-ci paraît agir directement au niveau de l'ADN, il était tentant d'envisager que ce pût être un polyribonucléotide dont l'association avec une séquence d'ADN aurait eu lieu par appariement spécifique. Cette hypothèse cependant, si elle peut rendre compte de la reconnaissance de l'opérateur, ne peut pas expliquer la reconnaissance de l'inducteur, la formation d'un complexe stéréospécifique avec une petite molécule étant apparemment le privilège exclusif des protéines. D'où la conclusion que le répresseur, c'est-à-dire le

Fig. 5.
Cinétique de la synthèse de galactosidase après induction de courte durée.
          A gauche: addition d'inducteur au temps 0. Elimination de l'inducteur après un temps correspondant à la largeur du rectangle hachuré. En ordonnées: accumulation de l'enzyme.
          A droite: quantité totale d'enzyme formé (asymptote de la courbe de gauche) portée en fonction de la durée de présence de l'inducteur. La relation linéaire trouvée indique que l'interaction inductrice est pratiquement immédiate et réversible (43).

produit actif du gène i, doit être une protéine. Cette hypothèse fondée jusqu'à présent exclusivement sur des considérations de pure logique, vient de recevoir une confirmation qui, pour être indirecte, n'en paraît pas moins décisive.
          Il faut rappeler que, grâce aux travaux de Benzer (40), de Brenner (41) et de Garen (42), une classe particulièrement remarquable de mutations a été reconnue, dites mutations "non-sens". Ces mutations entraînent, comme on sait, I'interruption de la lecture du messager en chaîne polypeptidique. Mais d'autre part, certains "suppresseurs" aujourd'hui bien identifiés, peuvent restaurer la lecture des triplets (UAG et UAA) correspondant aux mutations non-sens. Qu'une mutation donnée soit restaurable par l'un des suppresseurs ainsi soigneusement catalogués apporte la preuve que le phénotype du mutant correspondant est dû à l'interruption de la synthèse d'une protéine. Utilisant ce principe, Bourgeois, Cohn et Orgel (Loc. cit.) ont démontré que certains mutants constitutifs du gène i sont des mutants non-sens et que, par conséquent le produit actif de ce gène est une protéine.
          Ce résultat, illustrant le surprenant pouvoir d'analyse de la génétique biochimique moderne, est d'une importance exemplaire. Il faut souligner que, portant sur la suppression d'un mutant constitutif (i-), il démontre que la reconnaissance de l'opérareur (et non pas seulement celle de l'inducteur) est liée à la structure de la protéine produite par le gène i.
          Reste cependant entier le problème du mécanisme moléculaire qui permet à cette protéine de jouer le rôle de relais entre l'inducteur et l'opérateur. Ce problème est demeuré jusqu'à présent inaccessible à l'expérimentation directe, faute que le répresseur lui-même ait pu encore être isolé et étudié in vitro. Mais je voudrais, pour terminer, expliquer pourquoi et comment cette inaccessibilité elle-même a été pour nous la source de préoccupations nouvelles que nous espérons fructueuses.
          Il faut rappeler d'abord qu'à plusieurs reprises et avant même que l'existence du répresseur ne fut démontrée, nous avions tenté d'apprendre quelque chose sur le mode d'action de l'inducteur en le suivant à la trace in vivo grâce au marquage radioactif. Successivement Georges Cohen, François Gros, Agnès Ullmann, se sont engagés dans cette voie en utilisant différentes techniques de fractionnement. Certaines de ces tentatives ont conduit à des découvertes inattendues et importantes telles que celle de la galactoside-perméase et de la galactoside-transacétylase. Mais pour ce qui concerne le mode d'action des galactosides en tant qu'inducteurs, les résultats ont été totalement négatifs. Rien n'indique que l'interaction inductrice s'accompagne d'une altération chimique tant soit peu stable, d'une réaction covalente quelconque, de l'inducteur lui-même. La cinétique même de l'induction étudiée de façon raffinée par Kepes (43) (44) (45) montre d'ailleurs que l'interaction inductrice est extrêmement rapide et entièrement réversible (Fig. 5).
          C'est là, si l'on y songe, un bien remarquable phénomène puisque cette interaction stéréospécifique non covalente et réversible ­ interaction qui, selon toute vraisemblance, n'intéresse qu'un très petit nombre de molécules et ne peut mettre en jeu qu'une énergie très faible ­ déclenche tout le mécanisme compliqué de la transcription d'un opéron, de la lecture du message et la synthèse de trois protéines, impliquant la formation de plusieurs milliers de liaisons peptidiques. Dans tout ce processus, I'inducteur agit semble-t-il exclusivement comme un signal chimique reconnu par le répresseur, mais non comme participant direct à l'une quelconque des réactions qu'il déclenche.
          On pourrait être tenté de considérer comme invraisemblable cette interprétation de l'interaction inductrice si l'on ne connaissait pas aujourd'hui de nombreux exemples de mécanismes comparables intervenant dans la régulation non plus de la synthèse, mais de l'activité, de certains enzymes. Aussi est-ce d'abord en tant que modèle possible de l'interaction inductrice que nous nous sommes beaucoup intéressés depuis quelques années, Jacob, Changeux et moi-même, aux enzymes régulateurs (46) (47). Le premier exemple en fut sans doute la phosphorylase b du muscle de lapin qui, ainsi que l'ont montré Cori (48) et son école (Réf. in (49) ), est activé spécifiquement par le 5'AMP, sans que pour autant le nucléotide participe en aucune façon à la réaction. On doit à Novick et Szilard (50), à Pardee (51) et à Umbarger (52), d'avoir, par leur découverte de l'effet de rétro-inhibition qui règle le métabolisme des biosynthèses, renouvelé l'étude et démontré l'extrême importance de ces phénomenes.
          A l'occasion d'une revue qui leur était consacrée (53), la comparaison systématique et l'analyse des propriétés d'un certain nombre d'enzymes régulateurs nous a conduits à la conclusion que dans la plupart des cas sinon tous, les effets observés étaient dus à des interactions indirectes entre récepteurs stéréospécifiques distincts, à la surface de la molécule de protéine. Interactions transmises, selon toute vraisemblance, par l'intermédiaire d'une modification de conformation induite ou stabilisée lors de la formation, d'un complexe entre enzyme et effecteur spécifique. D'où le nom d'"effets allostériques" par lequel nous avons proposé de distinguer cette classe particulière d'interactions et le terme de "transitions allostériques" pour désigner la modification subie par la protéine (Fig. 6).
          Du fait qu'elles sont indirectes, les interactions allostériques ne doivent rien en définitive à la structure ou à la réactivité chimique particulière des ligands eux-mêmes, mais tout à la structure de la protéine qui agit à la manière d'un relais. C'est là ce qui confère leur signification profonde à ces effets. Le métabolisme, la croissance, la division d'une cellule exigent de toute évidence que fonctionnent non seulement les voies métaboliques principales ­ celles par où passe l'essentiel du potentiel et des matériaux chimiques mais aussi que, grâce à un réseau d'interactions spécifiques appropriées, l'activité des différentes voies métaboliques soit étroitement et précisément coordonnée. La construction, le perfectionnement de tels circuits au cours de l'évolution eut été évidemment impossible si seules des interactions directes, fut-ce à la surface d'une protéine, avaient été employées: celles-ci auraient été limitées précisément par la structure chimique, la réactivité ou l'absence de réactivité des métabolites entre lesquels l'existence d'une interaction pouvait être physiologiquement bénéfique. "L'invention" des interactions indirectes, allostériques, dépendant exclusivement de la construction de la protéine elle-même, c'est-à-dire du programme génétique, libérait l'évolution moléculaire de cette contrainte (53).
          L'inconvénient de cette conception, c'est justement que son pouvoir d'explication est si grand qu'elle n'exclut rien ou presque: il n'est pas de phénomène physiologique, si complexe et mystérieux soit-il, dont on ne puisse disposer, au moins sur le papier, à l'aide de quelques transitions allostériques. Aussi étais-je bien de l'avis de mon ami Boris Magasanik qui me faisait observer, il y a quelques années, que c'était la théorie la plus décadente de la Biologie.
          D'autant plus décadente qu'il n'y avait pas de raison, a priori, de supposer que les transitions allostériques fussent de même nature et obéissent aux mêmes règles pour des protéines différentes. On pouvait penser que chaque système allostérique constituait une solution particulière et unique d'un problème de régulation donné. Cependant, à mesure que s'accumulaient les données expérimentales relatives à différents enzymes allostériques, de remarquables analogies étaient révélées entre des systèmes qui n'avaient rien de commun. A cet égard, la confrontation des observations faites indépendamment par Gerhart et Pardee (54) (55) (56) (57) sur l'aspartate-transcarbamylase et par Changeux (58) (59) (60) sur la thréonine-désaminase d'Escherichia coli était particulièrement impressionnante.
          Dans leur complexité elle-même, les interactions, dans ces deux systèmes, présentaient des caractéristiques cinétiques inhabituelles, presque paradoxales, et cependant entièrement parallèles. Aussi ne pouvait-on guère douter que la même solution de principe au problème des interactions allostériques avait été trouvée par l'évolution dans les deux cas: il ne restait plus au chercheur qu'à tenter de la découvrir à son tour.

Fig. 6.
Modèle de transition allostérique se produisant dans un dimère symétrique.
          Dans l'une des deux conformations, la protéine peut s'associer au substrat ainsi qu'au ligand activateur. Dans l'autre conformation, elle peut s'associer au ligand inhibiteur.

          Parmi les propriétés communes à ces deux systèmes, ainsi qu'à la grande majorité des enzymes allostériques connus, la plus significative nous paraissait être le fait que leurs lois de saturation n'étaient pas linéaires (comme c'est le cas pour les enzymes "classiques"), mais multimoléculaires. Or on connaît depuis longtemps un exemple d'une telle loi de saturation: c'est celle de l'hémoglobine par l'oxygène (Fig. 7). Jeffries Wyman avait, il y a plusieurs

Fig. 7.
Saturation de l'hémoglobine par l'oxygène.
          En abscisses: pression partielle d'O2.
          En ordonnées: fraction saturée.
         Les points correspondent à des points expérimentaux (Lyster, résultats non publiés). La courbe d'interpolation est calculée d'après un modèle théorique semblable, pour l'essentiel, à celui de la Fig. 6.

Fig. 8.
Activité de la désoxy-cytidine désaminase en fonction de la concentration de substrat (dCMP), d'activateur (dCTP) et d'inhibiteur (dTTP).
          En haut: résultats expérimentaux d'après Scarano (cf. (65)).
          En bas: courbe théorique calculée pour une situation similaire d'après le modèle de Monod, Wyman et Changeux (66).

années déjà (61), noté que la symétrie des courbes de saturation de l'hémoglobine par l'oxygène paraissait suggérer l'existence d'une symétrie de structure de la molécule de protéine elle-même: hypothèse que les travaux de Perutz devaient brillamment confirmer ( 62 ) .
          Ces indications nous ont encouragés, Wyman, Changeux et moi-même, à chercher une interprétation physique des interactions allostériques en termes de structure moléculaire. Cette exploration nous a conduits à étudier les propriétés d'un modèle défini pour l'essentiel par les postulats suivants:
          a. Une protéine allostérique est constituée par plusieurs sous-unités (protomères) identiques.
          b. Les protomères sont assemblés de façon telle qu'aucun d'entre eux ne peut être distingué des autres; ce qui implique la présence d'un ou plusieurs axes de symétrie moléculaire.
          c. Deux (ou plusieurs) états conformationnels sont accessibles à cette protéine.
          d. Ces transitions conformationnelles tendent à conserver la symétrie moléculaire ou, plus généralement, l'équivalence des protomères (65).
          Ce fut pour nous une heureuse surprise de constater que ce modèle très simple permettait d'expliquer, de classer et de prévoir la plupart des propriétés cinétiques, parfois très complexes en apparence, de nombreux systèmes allostériques (Fig. 7 et 8).
          Ce modèle ne correspond, évidemment, qu'à une première approximation dans la description des systèmes réels. Il est vraisemblable d'ailleurs qu'il ne représente pas l'unique solution trouvée par l'évolution au problème des interactions régulatrices: certains systèmes paraissent fonctionner sur des principes tout différents (cf (63) ) qu'il s'agira aussi d'élucider.
          Cependant, l'ambition de la Biologie Moléculaire est d'interpréter les propriétés essentielles des organismes en termes de structures moléculaires. Ce but est déjà atteint pour l'ADN. Il est en vue pour les ARN. Il paraît très lointain encore pour les protéines. L'intérêt du modèle que nous avons étudié tient avant tout à ce qu'il propose une corrélation fonctionnelle entre certains éléments de la structure moléculaire des protéines et certaines de leurs propriétés physiologiques: celles justement qui interviennent au niveau de l'intégration, de l'organisation dynamique, du métabolisme. Que la corrélation proposée soit vérifiée par l'expérience, j'y verrais une raison supplémentaire de confiance dans le développement de notre discipline qui, dépassant son domaine primitif, la chimie de l'hérédité, s'oriente aujourd'hui vers l'analyse des phénomènes biologiques les plus complexes: le développement des organismes supérieurs, le fonctionnement de leurs réseaux de coordinations fonctionnelles.

Les recherches poursuivies par mes collaborateurs et moi-même depuis 1945 ont été entièrement effectuées à l'Institut Pasteur. Ces travaux ont reçu une aide décisive de la part de nombreuses institutions, en particulier le Centre National de la Recherche Scientifique, la Fondation Rockefeller de New York, la "National Science Foundation" des Etats-Unis, le "Jane Coffin Childs Memorial Fund", les "National, Institutes of Health" des Etats-Unis, le Commissariat à l'Energie Atomique, la Délégation Générale à la Recherche Scientifique et Technique. Un don de Madame Edouard de Rothschild et de Madame Bethsabée de Rothschild a, pour une large part, permis l'installation du service de Biochimie Cellulaire à l'Institut Pasteur, en 1954.

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MON.Mss.04, Dossier n° 6.1