Projets de recherche

Les leptospires et la leptospirose


  Les leptospires appartiennent au phylum des spirochètes et sont constitués de bactéries saprophytes et pathogènes. Les leptospires sont des bactéries fines (0,1 micromètre de diamètre) de forme hélicoïdale qui possèdent un organe locomoteur interne, l’endoflagelle.




 

mouvemtlepto1.jpg
Mouvement des leptospires (A, d’après Goldstein and Charon, 1988) et microscopie électronique de Leptospira biflexa (B)
 



Les espèces pathogènes sont responsables d’une zoonose: la leptospirose, où l’homme se retrouve être un hôte occasionnel dans un cycle impliquant les animaux sauvages et domestiques. La leptospirose est une zoonose de répartition mondiale et représente un problème de Santé Publique majeur dans de nombreux pays notamment en Amérique Latine et en Asie du Sud-Est. Le réservoir animal, principalement les rongeurs, excrète les leptospires dans ses urines et contamine ainsi l’environnement hydrique, propageant la maladie à d’autres animaux ou à l’homme.

cycleen2.jpg

Cycle de la leptospirose (d’après Faine et al. 1999)

On estime à 500 000 le nombre de cas sévères de leptospirose chaque année dans le monde, avec un taux de mortalité supérieur à 10%. En France, quelques 500 cas annuels sont diagnostiqués, dont la moitié provient des Départements et Territoires d’Outre-Mer où le taux d’incidence peut être 100 fois plus élevé qu’en Métropole. La France est parmi les pays industrialisés celui qui a le taux d’endémie le plus élevé. Dans les pays industrialisés des zones tempérées, la leptospirose est une maladie qui touche certaines catégories professionnelles exposées (éleveurs, égoutiers, pisciculteurs) et les adeptes de loisirs en plein air (pêche, rafting, canyoning) par contact avec les eaux douces souillées par les urines d’animaux infectés. Un récent rapport de l’Agence Française de Sécurité Sanitaire des Aliments (AFSSA) cite la leptospirose comme une des affections humaines dont l’incidence est susceptible d’être modifiée par le changement climatique en France métropolitaine.

Serveur Leptospires de l’Institut Pasteur avec situation épidémiologique en France


 

Il existe un traitement antibiotique contre la leptospirose, mais celui-ci doit être administré le plus rapidement possible pour éviter les formes les plus graves. Cependant, le diagnostic est souvent tardif au cours de l’infection. En effet, le spectre clinique de la leptospirose peut varier d’un état pseudo-grippal à une insuffisance rénale aiguë et ce syndrome peut être confondu avec d’autres maladies telles que le paludisme et la dengue. Des vaccins, généralement la souche tuée du sérovar prédominant, sont disponibles dans certains pays, mais cette vaccination engendre des effets secondaires et a une efficacité courte et incomplète. Il est à rappeler que la leptospirose touche aussi les animaux, avec un spectre d’hôte très large, provoquant d’importantes pertes économiques à travers le monde, notamment parmi les animaux d’élevage. Au sein de l’Unité de Biologie des Spirochètes, le Centre National de Référence (CNR) des Leptospires a pour mission d’effectuer la surveillance de cette zoonose, par recensement des cas grâce à son activité diagnostique et aux signalements des autres laboratoires en France métropolitaine et en Outre-Mer.

 


Centre Collaborateur OMS pour l’Epidémiologie de la Leptospirose


Centre National de Référence des Leptospires

 



Projets de recherche

 

Séquençage du génome de Leptospira biflexa et génomique comparative des leptospires

 

Le séquençage du génome des pathogènes L. interrogans sérovar Lai et L. interrogans sérovar Copenhageni a permis de déterminer environ 3500 cadres ouverts de lecture (ORFs) dont la moitié d’entre eux code pour des protéines de fonction inconnue. Le génome de ces leptospires se distingue de celui des autres bactéries par ses deux chromosomes circulaires de 4.5 Mb et 350 kb et par l’absence de plasmide. Cependant, peu d’outils génétiques sont disponibles pour l’étude de ces pathogènes. Au contraire, nous disposons pour les souches saprophytes telle que L. biflexa, de nombreux outils génétiques, tous développés dans notre Laboratoire, permettant, par exemple, la mutagénèse ciblée, la constitution de banques de mutants aléatoires, et la complémentation de mutants. Nous avons donc séquencé le génome de l’espèce saprophyte L. biflexa en collaboration avec le Pasteur Génopole Ile-de-France (Plate-Forme Génomique, C. Bouchier). En collaboration avec la Plate-Forme Intégration et Analyse génomique (C. Boursaux-Eude) et en utilisant l’interface web MaGe (C. Médigue, Genoscope d’Evry), nous avons annoté le génome qui est constitué de deux chromosomes circulaires de 3600 et 278 kb et un plasmide de 74 kb, avec un total de 3790 ORFs .

Spiroscope, comprenant le génome complet de Leptospira biflexa


 

L’analyse comparative des génomes de leptospires pathogènes avec celui de la souche saprophyte devrait être d’une grande utilité pour identifier des facteurs spécifiques au mode de vie des leptospires pathogènes et pour mieux comprendre l’évolution d’une bactérie de l’environnement en un important pathogène de l’animal et de l’homme.


 

Mutagénèse aléatoire et mutagénèse ciblée chez les leptospires pathogènes

Nous avons récemment développé un système de mutagénèse par transposition aléatoire d’un élément de la famille mariner chez le pathogène L. interrogans. Ce système nous a permis de débuter la construction d’une banque de mutants chez L. interrogans. Le génome de L. interrogans contient approximativement 3500 gènes, dont la moitié code des protéines de fonction inconnue. L’analyse d’une première série de mutants a permis d’isoler des souches présentant des insertions dans des possibles facteurs de virulence tels que des récepteurs TonB-dépendants, une sphingomyelinase, des peptidases, des protéines de la membrane, etc . Nous avons aussi isolé un mutant pour lequel un gène, loa22, codant une protéine possédant un domaine OmpA était inactivé. De précédentes études ont suggéré que cette protéine pouvait avoir un rôle majeur au cours de l’infection. Nous avons pu restaurer l’expression de ce gène par complémentation avec le gène sauvage. Nos résultats obtenus chez le cobaye montrent une atténuation significative de la virulence chez ce mutant par rapport à la souche sauvage et au mutant complémenté. Il s’agit de la première démonstration, en accord avec le postulat moléculaire de Koch, d’un facteur de virulence chez les leptospires pathogènes. Cette banque est un outil essentiel pour l’analyse fonctionnelle des gènes de leptospires, notamment pour la découverte de nouvelles fonctions.
L’analyse du génome de L. interrogans a permis d’identifier des facteurs de virulence potentiels. L’inactivation ciblée de ces gènes permettra d’établir expérimentalement le rôle de ces gènes dans la pathogénèse. La recombinaison homologue est possible chez le saprophyte L. biflexa après irradiation aux UV de l’ADN à délivrer dans la bactérie. Ce traitement préalable à la transformation semble ainsi stimuler le système de recombinaison et/ou de réparation de l’ADN dans la cellule hôte. Cependant, l’utilisation de la même stratégie chez les souches pathogènes s’est toujours révélée infructueuse jusqu’à récemment. Après de nombreux essais, nous avons finalement obtenu le premier échange allélique chez les leptospires pathogènes en utilisant la stratégie précédemment utilisée chez les saprophytes. Le clonage du gène ligB interrompu par une cassette de résistance dans un vecteur suicide a permis l’obtention de transformants issus d’un double évènement de recombinaison homologue. L’efficacité de transformation reste encore très faible et l’utilisation de régions flanquantes importantes et d’un gène contenant des domaines répétés a vraisemblablement favorisé la recombinaison. Nous envisageons maintenant d’inactiver d’autres facteurs de virulence putatifs. Pour ceci, l’amélioration de l’efficacité de transformation chez les leptospires pathogènes reste essentielle. On testera si la conjugaison, plutôt que l’électroporation, favorise la recombinaison homologue chez les pathogènes. Un panel de souches de leptospires pathogènes (collection du CNR des Leptospires) sera aussi utilisé afin d’identifier des souches hypertransformables.

 

conjecolepto3.jpg
Microscopie électronique de Leptospira biflexa et Escherichia coli au cours de la conjugaison

 

Développement de nouveaux outils génétiques

Il y a encore quelques années, la génétique des spirochètes, bactéries éloignées des bactéries modèles couramment étudiées, était inexistante. Ceci est principalement dû à leur temps de génération relativement élevé. Ainsi, les colonies des leptospires pathogènes apparaissent sur milieu solide après plus d’un mois d’incubation. Récemment, nous avons développé les premiers outils génétiques (vecteur navette, système d’inactivation de gènes, marqueurs de sélection et marqueur de contre-sélection) pour étudier les leptospires saprophytes. Cependant, la génétique des leptospires nécessite le développement de nouveaux outils génétiques, notamment pour la manipulation des leptospires pathogènes. L’expression d’une protéine fluorescente par les leptospires peut permettre de suivre le processus infectieux chez l’animal. Dans ce but, nous avons construit un plasmide réplicatif chez le saprophyte L. biflexa qui contient les gènes codant les protéines fluorescentes GFP ou mRFP1 sous contrôle d’un promoteur de leptospire. Après transformation de L. biflexa, nous avons ainsi obtenu la fluorescence (verte pour la GFP et rouge pour mRFP1) des transformants. Nous tentons maintenant de transférer ces gènes chez le pathogène L. interrogans en utilisant le transposon Himar1. Cet outil sera très utile pour suivre l’infection dans nos modèles animaux. Ceci permettra, par exemple, d’observer la formation de structure de type biofilm dans les tubules rénaux des rats. L’utilisation de leptospires fluorescents sera aussi très utile pour l’étude de l’interaction des leptospires avec une culture de cellules in vitro. En effet, les interactions de L. interrogans avec les cellules de l’hôte sont critiques pour la dissémination dans l’hôte. Enfin, on pourra aussi envisager de développer un système de gène rapporteur à l’aide des gènes de fluorescence pour examiner les profils d’expression des gènes d’intérêt dans différentes conditions.

 

fluo4.jpg
Microscopie à fluorescence de Leptospira biflexa exprimant les gènes gfp et mRFP1

 

 Identification de facteurs de virulence
 

Les mécanismes moléculaires de la pathogénèse de la leptospirose restent largement méconnus. Le principal objectif de ce projet est de générer des mutants chez les leptospires pathogènes par mutagénèse ciblée et aléatoire puis de déterminer si ces mutants sont atténués dans leur virulence dans les modèles animaux. Les leptospires ont la capacité de pénétrer dans l’organisme à travers le revêtement cutané lésé ou les muqueuses puis de disséminer dans les tissus rapidement après l’infection. Dans les hôtes sensibles, comme l’homme par exemple, l’infection systémique peut produire des manifestations sévères comme des insuffisances rénales ou hépatiques et des hémorragies pulmonaires. L’inoculation de leptospires virulents chez les cobayes reproduit une infection mortelle qui mime les signes cliniques des leptospiroses sévères chez les humains. Au contraire, dans le réservoir animal comme le rat domestique, l’infection donne une maladie chronique asymptomatique avec une colonisation des leptospires dans les tubules rénaux. Les mutants potentiellement impliqués dans la virulence seront testés dans le modèle cobaye, mais aussi chez le rat en collaboration avec la Fondation Fiocruz (Brésil) qui a développé ce modèle.
Ces dernières années, nous nous sommes plus particulièrement intéressés au métabolisme du fer chez les leptospires ainsi qu’à la capacité de ces bactéries à former des biofilms. Nous avons ainsi montré que la grande majorité des leptospires était capable de former des biofilms in vitro. Ce mécanisme pourrait permettre aux leptospires de survivre dans l’environnement. La formation de biofilms pourrait aussi permettre aux leptospires de coloniser les tubules rénaux des réservoirs animaux. L’analyse génomique des leptospires saprophytes et pathogènes permet d’identifier de nombreux transporteurs putatifs du fer. En effectuant le criblage d’une banque de mutants aléatoires obtenus par transposition ou l’inactivation ciblée de gène chez notre bactérie modèle, le saprophyte L. biflexa, nous avons identifié plusieurs gènes impliqués dans l’acquisition de différentes sources de fer, tels que des gènes codants des récepteurs dépendants de TonB, des transporteurs ABC, un système à deux composants, etc. Ces résultats devraient nous permettre une meilleure compréhension du rôle du fer dans la virulence des leptospires pathogènes chez l’hôte.


 

biofilm5.jpg
Biofilms de leptospires par microscopie électronique
 

L’implication des facteurs de virulence dans la pathogénèse sera confirmée par réintroduction du gène sauvage dans la souche mutante. A défaut de plasmide réplicatif pour les leptospires pathogènes, nous pourrons utiliser le transposon Himar1 contenant le gène à réintroduire. Pour ceci, on s’assurera que le site d’insertion du transposon n’affecte par des gènes importants pour la bactérie. Cette stratégie a été précédemment utilisée pour complémenter le mutant avirulent loa22.


 

Typage moléculaire des leptospires

Ce projet a pour but de répondre à un double besoin de diagnostic et d’identification rapide des leptospires pathogènes, en faisant appel à de nouvelles approches moléculaires basées sur l’analyse des VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) ou mini-satellites. Cette technique simple et rapide est maintenant utilisée en routine au CNR et donne satisfaction pour l’identification des principaux sérovars. Le nombre de souches isolées à partir de prélèvements de patients reste extrêmement faible (50-60 par an pour 500 cas diagnostiqués par la sérologie au CNR des Leptospires). Il est donc très difficile de connaître réellement l’épidémiologie de la leptospirose. En collaboration avec la Plate-forme de Génotypage des Pathogènes et Santé publique (PF8) de l’Institut Pasteur, nous envisageons maintenant d’améliorer la rapidité et la sensibilité de la technique d’identification par VNTR en passant dans un système de détection des produits d’amplification par capillaires. Les amplifications seront réalisées directement sur des sérums précoces de patients suspectés d’infection par des leptospires. L’ensemble de nos résultats sera archivé dans une base de données qui pourra être consultable sur internet (site MLVA-NET créé par la PF8) et permettre l’échange des données à travers le monde.

base de données MLVA

Mis à jour le 15/04/2014

Contact

Biologie des Spirochètes
Institut Pasteur
28 rue du docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France.
Tel: 33 (1) 45 68 83 37.
Fax: 33 (1) 40 61 30 01.
E-mail: spiroc@pasteur.fr

 

Agenda

Tout l'agenda